本研究由Patrick Reichenbach、Greta Maria Paola Giordano Attianese、Khaoula Ouchen、Elisabetta Cribioli、Melanie Triboulet、Sarah Ash、Margaux Saillard、Romain Vuillefroy de Silly、George Coukos和Melita Irving等人完成，他们来自瑞士洛桑大学医院和洛桑大学的路德维希癌症研究所洛桑分所（Department of Oncology, Ludwig Institute for Cancer Research Lausanne, Lausanne University Hospital and University of Lausanne）。该研究成果于2023年4月17日在线发表于Nature Biomedical Engineering，并在2023年9月第7卷第1063至1080页正式刊出。

本研究的学术背景聚焦于过继性T细胞疗法（adoptive T-cell transfer, ACT）在肿瘤免疫治疗中的应用与优化。以嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cells, CAR-T cells）和T细胞受体工程T细胞（T cell receptor-engineered T cells, TCR-T cells）为代表的基因修饰T细胞疗法已在部分血液系统恶性肿瘤中取得了显著疗效，但在实体瘤治疗中仍面临诸多障碍，包括肿瘤微环境（tumour microenvironment, TME）中的免疫抑制屏障以及全身性毒性风险。为了增强工程T细胞的功能并提高治疗安全性，研究者希望开发一种能够同时表达肿瘤靶向受体和条件性表达治疗性基因载荷（genetic payload）的“一体化”慢病毒载体（lentiviral vector）。传统的双启动子正向（sense）载体和双向（bidirectional）载体分别存在转录干扰（transcriptional interference）和启动子渗漏（promoter leakiness）的问题。本研究旨在设计一种新的双反义（antisense）慢病毒载体，以实现由组成型启动子驱动肿瘤靶向受体的稳定表达，同时由激活诱导型启动子控制基因载荷在T细胞活化后于肿瘤微环境中特异性表达，从而降低全身毒性并增强T细胞功能。

研究的工作流程分为多个关键步骤。首先，研究团队构建了三种不同构型的双基因慢病毒转移载体：双正向（dual sense）、双向（bidirectional）和双反义（dual antisense），并分别以绿色荧光蛋白EGFP作为组成型表达基因A（受磷酸甘油酸激酶启动子PGK驱动）和红色荧光蛋白mCherry作为诱导型表达基因B（受6×NFAT启动子驱动）。在Jurkat细胞中进行的初步筛选显示，双正向构型存在转录干扰，双向构型存在诱导型启动子渗漏，而双反义构型在刺激后表现出最高的EGFP和mCherry平均荧光强度（mean fluorescence intensity, MFI），且在未刺激状态下无mCherry渗漏表达。然而，在生产慢病毒颗粒时，双反义载体导致了显著降低的病毒滴度。研究团队发现，这是由双反义载体中5’长末端重复序列（long terminal repeat, LTR）与反向PGK启动子发生汇聚转录（convergent transcription）而产生双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA），进而触发了HEK293T细胞中Dicer介导的RNA干扰（RNA interference, RNAi）抗病毒反应，导致病毒基因组RNA被降解或转录沉默。为克服这一障碍，研究团队采取了两种策略。第一种策略是在包膜质粒上共表达诺达姆病毒RNA干扰抑制蛋白B2（Nodamuravirus B2, novB2），以抑制Dicer的活性，从而提高病毒滴度。第二种策略是针对病毒基因组转录不足的问题，将转移载体5’ LTR中原有的劳斯肉瘤病毒（Rous sarcoma virus, RSV）启动子替换为巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）启动子，该启动子包含四个NF-κB共识结合基序，并通过共转染人T细胞白血病病毒1型Tax蛋白（HTLV-1 Tax）来反式激活CMV启动子，促进病毒基因组单链RNA的转录。实验结果表明，单独使用novB2或Tax蛋白均能显著提高双反义慢病毒载体的滴度和转导效率，而联合使用两者则能进一步恢复病毒滴度至与正向载体相当甚至更高的水平。考虑到Tax蛋白的致癌性可能引起临床级病毒生产的监管顾虑，研究团队进一步寻找替代方案。他们利用肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor α, TNFα）作为一种能有效激活NF-κB通路的细胞因子，在HEK293T细胞生产病毒时加入TNFα，同样能够通过激活CMV启动子中的NF-κB结合基序来提高病毒滴度。TNFα与novB2联合使用可以达到与Tax和novB2联合使用类似的效果，且更适合药品生产质量管理规范（good manufacturing practice, GMP）的要求。在后续实验中，研究团队将该双反义载体系统应用于下一代CAR-T细胞和TCR-T细胞的制备。他们构建了编码抗PSMA或抗CD19的二代CAR（组成型表达）以及荧光素酶或mCherry作为诱导型基因载荷的慢病毒载体，并在体外实验中证实，由双反义载体工程化的CAR-T细胞在抗原刺激后表达了显著更高的诱导型基因载荷水平，而细胞杀伤活性与正向载体工程化的CAR-T细胞无显著差异。在体内实验中，研究者将表达荧光素酶的双反义载体工程化抗PSMA CAR-T细胞过继转移到荷瘤NSG小鼠体内，通过生物发光成像证实，只有浸润到肿瘤部位的CAR-T细胞在靶抗原存在下才特异性地表达荧光素酶，且其表达水平显著高于正向载体工程化的CAR-T细胞。此外，研究团队还验证了双反义载体用于表达微小RNA基短发夹RNA（miRNA-based short hairpin RNA, miR-based shRNA）的可行性。他们构建了一种在6×NFAT启动子控制下表达靶向造血祖细胞激酶1（haematopoietic progenitor kinase 1, HPK1）的miR-based shRNA的抗PSMA CAR-T细胞，并在T细胞活化后观察到超过90%的HPK1蛋白表达下调。研究还进一步拓展了双反义载体在组成型启动子SFFV下表达靶向T细胞受体α链（TCR-α）的miR-based shRNA，用于敲低内源性TCR的表达，从而减少外源TCR与内源TCR之间的错配。

本研究的主要结论是，双反义慢病毒载体设计能够有效避免双正向载体的转录干扰和双向载体的启动子渗漏，实现组成型肿瘤靶向受体与激活诱导型基因载荷的独立高效共表达。通过使用novB2蛋白抑制Dicer介导的dsRNA抗病毒反应，以及通过CMV启动子结合TNFα或Tax蛋白增强病毒基因组转录，可以克服双反义载体在生产过程中病毒滴度低下的问题，且该策略可转化为符合GMP要求的临床级病毒生产工艺。该载体系统在体外和体内实验中均表现出良好的功能性和安全性，诱导型基因载荷仅在T细胞识别肿瘤抗原后在肿瘤微环境中特异表达，从而降低全身性毒性风险。本研究的科学价值在于揭示了慢病毒载体生产过程中汇聚转录引发的dsRNA-RNAi抗病毒机制对病毒滴度的限制，并提出了一种通用的解决方案。其应用价值在于为下一代CAR-T和TCR-T细胞疗法提供了一种高效、安全且成本可控的载体平台，有望推动更多实体瘤患者受益于工程T细胞免疫治疗。本研究的亮点包括：首次系统比较了三种双基因慢病毒载体构型的优缺点，明确了双反义构型的优势；发现了双反义载体生产中低滴度的分子机制，并创新性地利用novB2和TNFα等工具恢复病毒滴度；证明了该载体系统可用于表达多种类型的基因载荷，包括细胞因子、荧光报告基因和miR-based shRNA；并在体内实验中验证了诱导型基因载荷在肿瘤微环境中的特异性表达。