这篇研究论文由Eleonora Macchia、Cinzia Di Franco、Cecilia Scandurra、Lucia Sarcina、Matteo Piscitelli、Michele Catacchio、Mariapia Caputo、Paolo Bollella、Gaetano Scamarcio和Luisa Torsi共同完成，作者来自意大利巴里大学（Università degli Studi di Bari Aldo Moro）、芬兰奥博学术大学（Åbo Akademi University）以及意大利国家研究委员会（CNR）等机构。研究发表于《Advanced Materials》期刊2025年第37卷，文章编号2418610，是一篇开放获取论文，遵循知识共享署名许可协议。
该研究属于生物传感与纳米技术交叉领域，聚焦于解决蛋白质检测灵敏度远低于核酸扩增技术的瓶颈问题。尽管聚合酶链式反应（PCR）可通过扩增实现单拷贝核酸（10⁻²⁰ M）检测，但蛋白质免疫检测的灵敏度通常局限在10⁻⁹ M范围。表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）作为主流检测技术，其典型检测限（LOD）为10⁻⁹ M。本研究通过开发新型等离子体单分子检测方法，首次实现了蛋白质和DNA在10⁻²⁰ M（0.1 mL中1±1个分子）的超灵敏检测，即使在血清样本中也能在1小时内完成，较传统SPR技术提升了11个数量级。
研究团队在毫米级金基底上物理吸附了万亿级识别元件（抗体或蛋白质-探针复合物），形成厚度5-9 nm的单分子层。通过酸性（pH 6）或碱性（pH 8）预处理使生物层进入亚稳态，这种pH调控被证明是触发后续信号放大的关键步骤。实验系统比较了三种生物传感体系：
- HIV-1 p24抗原检测：使用抗HIV-1-p24单克隆抗体，以C反应蛋白（CRP）作为干扰物
- IgG检测：采用抗IgG多克隆抗体，IgM作为对照
- KRAS基因检测：通过中性亲和素-生物素化KRAS探针（NA-b-KRAS）识别胰腺癌标志物KRAS突变基因，TP53基因作为阴性对照
研究采用多模态表征手段：
- SPR检测：通过Kretschmann构型实时监测激光入射角δθspr变化，在pH调控后的生物层中，”单分子”（10⁻²⁰ M）和”少量分子”（10⁻¹⁹ M）结合事件可产生显著信号（δθspr达8.2×10⁻³°和14.6×10⁻³°），而未经pH处理的对照组无响应。
- 电位分析技术：
- 电解质门控有机场效应晶体管（EGOFET）：监测阈值电压（V_T）偏移，发现pH调控后单分子结合可引起(20±2) mV的V_T正移
- 开尔文探针力显微镜（KPFM）：显示单个结合事件可引发亿级识别元件的表面电位协同变化（δSPD达-106 mV）
- Zeta电位测试：证实结合后生物层等电点从3.8降至3.4，表面电荷密度增加
通过静态接触角（SCA）、纳米力学测试和偏振调制红外反射吸收光谱（PM-IRRAS）揭示：
- pH调控诱导蛋白质部分解折叠，暴露疏水区域形成非晶态聚集体
- 单个结合事件通过疏水相互作用触发自传播聚集，导致生物层刚性降低37%，粘附力增加66%
- 每10²个识别元件产生1.5e等效电荷位移，形成静电重排放大效应
该研究首次揭示了蛋白质生物材料中未被认识的亚稳态放大现象，提出”大界面单分子检测（SIMOLS）”新范式：
- 科学意义：重新定义了蛋白质构象变化与宏观电学响应的关联机制，为生物分子相互作用研究提供新工具
- 临床转化：基于该原理开发的便携式SPR设备可用于HIV、癌症等疾病的超早期诊断，目前已进入临床前阶段（参见single molecule.center）
- 技术革新：相比需要纳米结构增强的传统SPR，该方法仅需毫米级裸金基底，大幅降低成本
研究通过22因子实验设计证实，仅pH改变（而非离子强度变化）是激活单分子检测的关键参数。此外，PM-IRRAS数据显示α-螺旋含量轻微增加（IRR从2.59升至2.81），排除了β-淀粉样纤维形成的可能，确认为非晶态聚集路径。这一发现为理解蛋白质界面行为提供了新视角。