免疫检查点抑制剂相关心肌炎患者心脏、血液和肿瘤中的免疫反应研究
作者与发表信息 本研究由Steven M. Blum、Daniel A. Zlotoff、Alexandra-Chloé Villani等众多研究者合作完成。主要研究人员来自多个机构，包括麻省总医院免疫与炎症疾病中心、麻省总医院癌症中心、麻省理工学院和哈佛大学的博德研究所、哈佛医学院、Krantz家族癌症研究中心以及多个其他相关科室。这项研究成果于2024年12月5日发表在《自然》期刊上。
学术背景 本研究属于免疫肿瘤学和心脏免疫学的交叉领域。免疫检查点抑制剂作为一种革命性的抗癌疗法，已被广泛用于多种肿瘤类型，能够显著改善癌症患者的预后。然而，这类疗法会引发一系列免疫相关不良事件，其中免疫相关心肌炎是死亡率最高（20-50%）的严重并发症之一，其病理生理机制以及与抗肿瘤免疫之间的关系尚未被完全阐明。先前的研究虽然发现irMyocarditis（免疫相关心肌炎）患者心脏中存在T细胞和炎性巨噬细胞浸润，并且有小鼠模型研究提示心肌特异性蛋白α-肌球蛋白可能作为自身抗原驱动T细胞反应，但关于人类患者中驱动心肌炎的免疫细胞特征、T细胞克隆特异性及其与肿瘤内克隆的关系、以及在心脏和血液中是否存在可预测疾病严重程度的生物标志物等关键问题，仍然缺乏系统性的认识。
因此，本研究的目的是：利用单细胞RNA测序、T细胞受体测序、显微技术和蛋白质组学等多组学技术，对免疫相关心肌炎患者的心脏、血液和肿瘤样本进行系统性分析，以明确驱动irMyocarditis的免疫反应特征，并探索其与抗肿瘤免疫的关系，最终为理解病理机制、识别生物标志物提供关键见解。
详细研究流程 本研究是一项系统性、多层面的观察性研究，其工作流程复杂而严谨，主要包含以下几个核心环节：
1. 研究设计与样本收集 研究人员从麻省总医院收集了癌症并发irMyocarditis患者，以及接受了免疫检查点抑制剂治疗但未发生心肌炎的患者样本。具体包括： * 心脏组织样本：通过心内膜心肌活检或早期尸检获取。共分析了28名irMyocarditis患者和41名未受影响个体的样本。用于单细胞RNA测序的心脏组织样本共19例（15例来自心内膜活检，4例来自尸检），其中irMyocarditis 13例，对照6例（包含2例未受影响患者和4例来自公开心脏图谱的非癌症非免疫治疗者）。 * 血液样本：收集了外周血单个核细胞和血清。血液样本来自30名免疫治疗无不良事件的患者和25名irMyocarditis患者。对于irMyocarditis患者，样本采集时间点包括：治疗前、治疗后但心肌炎发生前、心肌炎发生但使用皮质类固醇治疗前、以及接受皮质类固醇或其他免疫抑制治疗之后。总共分析了366,066个血液细胞。 * 肿瘤样本：在可能的情况下，从irMyocarditis尸检病例中收集配对的肿瘤组织及肿瘤邻近正常组织，用于免疫组化、多重显微成像和批量T细胞受体测序分析。
2. 单细胞多组学分析 这是本研究的核心技术手段。 * 单细胞RNA测序：对心脏组织和PBMC样本进行单细胞RNA测序，以获得每个细胞的转录组图谱。心脏样本共获得84,576个细胞的转录组数据，PBMC样本获得366,066个细胞的转录组数据。该方法能够解析心脏和血液中所有免疫细胞和非免疫细胞的组成和状态。 * T细胞受体测序：与单细胞RNA测序或批量测序相结合，用于追踪和分析T细胞克隆的组成、扩增情况及在不同组织间的共享关系。特别关注了心脏中扩增的T细胞克隆是否也在血液或肿瘤中出现。 * 蛋白质组学分析：对血清样本中的71种蛋白质进行检测，以评估irMyocarditis发生时机体循环中的蛋白水平变化。 * CITE-seq：对PBMC样本，联合使用细胞索引转录组和表位测序技术，该技术能同时获得单细胞的转录组信息及其表面蛋白表达情况，类似高度多重化的流式细胞术，用于正交验证基于RNA的聚类分析结果。
3. 组织成像验证 使用多重RNA原位杂交和免疫荧光技术对心脏组织切片进行分析，旨在空间层面上验证单细胞测序的发现。具体目标是： * 验证心脏组织中常规树突状细胞的存在和定位。 * 观察表达炎症趋化因子的成纤维细胞的存在及其与免疫细胞的空间共定位关系。 * 分析在炎症区域这些细胞类型的密度和邻近性。
4. T细胞受体抗原特异性筛选 为了检验心脏中扩增的T细胞克隆是否靶向已知的心脏自身抗原，研究人员设计了体外T细胞激活试验。他们从8名患者的irMyocarditis心脏组织中分离出52个高度扩增的TCR序列，并使用慢病毒载体将其转导入健康的T细胞中。这些工程化的T细胞随后被暴露于包含α-肌球蛋白、肌钙蛋白I或肌钙蛋白T肽段的肽池中。通过检测T细胞活化标记物（如CD137）的表达，来判断这些TCR是否能识别这些假定自身抗原。
5. 数据分析工作流程 研究团队开发并应用了复杂的生物信息学分析流程来处理海量数据： * 细胞聚类与注释：利用无监督聚类算法将单细胞数据划分为不同的细胞亚群，并根据已知的标记基因对每个亚群进行细胞类型注释（如细胞毒性T细胞、常规树突状细胞、炎性成纤维细胞等）。 * 丰度分析与差异表达：比较irMyocarditis组和对照组之间各细胞亚群的频率差异，并识别在每个细胞类型中差异表达的基因。 * 基因集富集分析：评估特定生物学通路（如干扰素反应、同种异体移植排斥、细胞粘附等）在特定细胞群体中是否被激活。 * TCR克隆分析：计算TCR克隆的多样性和克隆扩增程度；通过统计方法鉴定在心脏或肿瘤组织中相对于配对正常组织显著富集的TCR克隆；分析心脏和血液特定T细胞亚群之间的TCR序列共享情况。 * 关联分析：将细胞亚群频率或基因表达水平与血清肌钙蛋白T（心肌损伤的生物标志物）水平进行关联，以寻找与疾病严重程度相关的潜在标志物。
主要研究结果 1. 心脏与血液细胞群体的系统性重塑 * 心脏组织：单细胞分析显示，irMyocarditis患者心脏中T/NK细胞频率显著增加。这些细胞富含细胞毒性基因和趋化因子受体CXCR3。此外，常规树突状细胞、炎性成纤维细胞也呈现增加趋势。基因集富集分析显示，在多种细胞类型中，与同种异体移植排斥、抗原提呈、干扰素反应和细胞粘附相关的通路被激活。 * 血液系统：分析发现，irMyocarditis患者血液中浆细胞样树突状细胞、常规树突状细胞、B细胞谱系细胞和CD4 T细胞的频率显著降低。相反，其他单核吞噬细胞的频率增加。重要的是，血液中单核吞噬细胞的频率与血清肌钙蛋白T水平呈正相关，提示其可能与心肌损伤程度有关。CITE-seq的表位分析结果进一步验证了这些基于RNA的发现。
2. T细胞克隆在心脏、肿瘤和血液中的分布与关系 * 心脏与肿瘤克隆的区分：对配对的心脏、肿瘤及邻近正常组织的TCRβ测序分析表明，在心脏组织中富集的T细胞克隆与在肿瘤组织中富集的克隆大部分不重叠。尽管存在少数共享克隆，但在每位患者中，心脏里扩增程度最高的克隆并非在肿瘤中富集。这表明驱动irMyocarditis的T细胞克隆与驱动抗肿瘤免疫的克隆在很大程度上是独立的。 * 血液中的预测性生物标志物：研究发现，心脏中富集的TCR克隆与血液中一个特定的“循环CD8 T细胞”亚群存在序列共享。关键发现是：在致命性irMyocarditis病例中，这种心脏-血液循环CD8 T细胞之间的TCR共享程度显著高于非致命性病例。这个血液中的循环CD8 T细胞亚群高表达激活和细胞周期基因，可能成为预测疾病严重程度的潜在生物标志物。 * 对已知自身抗原的应答：对52个心脏扩增TCR的抗原特异性筛选结果显示，它们均不能识别假定的心脏自身抗原α-肌球蛋白、肌钙蛋白I或肌钙蛋白T。这提示在本次研究的人群中，最主要的致病性T细胞克隆可能靶向其他未知的抗原。
3. 心脏微环境中的关键细胞互作 * 常规树突状细胞的空间定位：多重显微成像证实，irMyocarditis心脏组织中cDCs显著增多，并且它们与CD8 T细胞在空间上非常接近，这种共定位在对照组织中未观察到。cDCs在心脏中的频率也与血清肌钙蛋白T水平相关。 * 炎性成纤维细胞的发现与功能：单细胞分析揭示了一个独特的成纤维细胞亚群，其高表达CXCL9、CXCL10、CXCL11等趋化因子以及MHC II类分子。这些“CXCL9高HLA-DRA高成纤维细胞”的频率同样与血清肌钙蛋白T水平正相关。空间成像进一步确认了这些同时表达胶原蛋白和炎性趋化因子的成纤维细胞的存在，它们位于炎症区域，并与cDCs和CD8 T细胞相邻。这类细胞具有之前在其他自身免疫性疾病中描述的“炎性成纤维细胞”的特征，但在irMyocarditis中是首次被系统描述。
结论与意义 本研究通过整合多组学技术，首次全面描绘了免疫检查点抑制剂相关心肌炎在心脏、血液和肿瘤三个层面的免疫图谱，并得出以下核心结论： 1. 病理模型：irMyocarditis的病理生理过程涉及一个协调的免疫反应网络。自体反应性细胞毒性CD8 T细胞和抗原提呈细胞（如cDCs）被募集并滞留在心脏，这一过程可能受到心脏驻留的炎性成纤维细胞通过分泌CXCR3配体等趋化因子所驱动。免疫细胞与非免疫细胞（成纤维细胞）共同构成了致病的微环境。 2. 克隆特异性：驱动心肌炎的主要T细胞克隆在很大程度上与驱动抗肿瘤免疫的克隆不同，且不识别先前提出的主要心脏自身抗原（α-肌球蛋白等），这意味着可能存在新的、尚未被鉴定的自身或交叉反应抗原。 3. 生物标志物：研究识别出多个潜在的诊断和预后生物标志物，包括：血液中单核吞噬细胞频率升高、pDCs和cDCs频率降低；以及血液中与心脏克隆共享TCR的循环CD8 T细胞，其水平与致命性结局强相关，具有极高的预后价值。 4. 治疗启示：研究强调了CXCR3趋化因子轴在irMyocarditis发病中的核心作用，为开发靶向该通路的新型治疗策略（例如使用CXCR3拮抗剂）提供了理论依据，但需平衡其对抗肿瘤免疫的可能影响。
研究亮点 1. 系统性多组学分析：首次对irMyocarditis患者的配对心脏、血液和肿瘤样本进行如此深度的单细胞分辨率整合分析，提供了前所未有的全景视图。 2. 关键的机制发现：明确了心脏中炎性成纤维细胞、cDCs与细胞毒性T细胞的空间互作网络，构建了更完善的病理模型。 3. 创新的生物标志物：发现血液中携带心脏特异性TCR的循环CD8 T细胞亚群与死亡率相关，这是一个具有重要转化潜力的发现。 4. 挑战既有认知：研究结果表明，在人类患者中，最主要的致病T细胞克隆不识别α-肌球蛋白，且与肿瘤反应性克隆有区别，这对该领域的现有理论提出了重要修正和补充。 5. 方法学严谨性：通过使用肿瘤邻近正常组织作为对照来定义组织富集的TCR克隆，以及利用CITE-seq进行正交验证，极大地增强了研究结果的可靠性。
其他有价值的内容 研究还观察到，部分irMyocarditis患者心脏中存在转移性肿瘤病灶，并且炎症既可出现在肿瘤附近，也可出现在远离肿瘤的部位。即使排除这些有心脏转移的病例样本，主要的分析结果依然保持稳健，这进一步强化了irMyocarditis作为一种独立免疫病理过程的结论。此外，研究分析了皮质类固醇治疗对免疫细胞转录组的影响，发现治疗后基因表达谱发生显著改变，这强调了在定义疾病相关特征时使用治疗前样本的重要性。
这项研究极大地增进了我们对免疫检查点抑制剂相关心肌炎这一致命并发症的理解，为未来的机制研究、风险分层和精准治疗策略开发奠定了坚实的基础。