电针激活的线粒体靶向聚合自由基用于cGAS-STING通路激活的免疫治疗
第一， 研究作者、机构及发表信息 本项研究由来自中国多所研究机构的科学家团队共同完成。Yuanying Li, Renhao Nie, Changhan Yan, Yaolan Tao, Xiyin Liu, Huiying Ning, Ke Yuan, Zihan Liu, 和 Zhenjia Liu 来自西北工业大学（Northwestern Polytechnical University）的柔性电子国家与地方联合实验室、柔性电子前沿科学中心、西安柔性电子研究院及西安生物医学材料与工程研究院。Yunxiu Zhang 作为通讯作者来自西北师范大学（Northwest Normal University）化学化工学院。另外两位通讯作者 Qingyan Jia 和 Peng Li 同属于西北工业大学上述机构，其中 Peng Li 教授还在河南大学河南柔性电子研究院暨柔性电子学院以及苏州城市大学担任职务。Wei Huang 教授作为通讯作者，同样隶属于西北工业大学和河南大学的柔性电子研究机构。 该研究以题为《Electroacupuncture-Activated Mitochondria-Targeted Polymeric Radicals for cGAS-STING-Activated Immunotherapy》的学术论文形式，发表于化学领域的顶级期刊《Journal of the American Chemical Society》（JACS）。论文于2025年11月4日收到，经修订后于2026年2月3日被接受，并于2026年2月16日正式在线出版，卷期号为2026年第148卷，页码从8447至8463页。
第二， 研究的学术背景与目的 本研究属于交叉学科领域，主要涉及生物材料化学、肿瘤治疗学和免疫学。其核心科学背景在于探索利用自由基进行癌症治疗的新策略。自由基具有未成对电子，反应活性高，能通过诱导细胞氧化应激（造成脂质过氧化、蛋白质损伤、DNA双链断裂等）来杀伤肿瘤细胞。然而，传统的氧依赖性自由基（如超氧阴离子、羟基自由基）疗法，如光动力疗法（PDT）和化学动力疗法（CDT），其疗效严重受限于肿瘤微环境（TME）中的缺氧和过氧化氢含量不足。 近年来，一种新兴的电动力学疗法（Electrodynamic Therapy， EDT）引起了关注。EDT利用电场（例如通过针状电极施加）刺激电敏剂，以不依赖于微环境的方式分解水产生羟基自由基，展现出克服肿瘤缺氧壁垒的潜力。更重要的是，EDT能够诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡，从而激活全身性的抗肿瘤免疫反应。 另一方面，cGAS-STING（环鸟苷酸-腺苷酸合成酶-干扰素基因刺激蛋白）通路在启动先天性免疫反应中扮演着关键角色。最近的研究表明，治疗中产生的自由基可导致线粒体功能障碍和线粒体DNA氧化损伤，进而引起mtDNA泄漏至细胞质，激活cGAS-STING信号通路。该通路的激活能够促进I型干扰素表达、树突状细胞成熟、CD8+ T细胞和自然杀伤细胞的增殖与肿瘤浸润，从而增强抗肿瘤免疫。 基于以上背景，本研究旨在开发一种创新的、能够克服肿瘤微环境障碍并协同增强免疫治疗效果的策略。具体研究目标包括：1）设计并合成一种能在电场刺激下产生稳定、不依赖于氧气的有机自由基的新型材料；2）实现该材料对肿瘤细胞线粒体的特异性靶向；3）探究这些有机自由基通过干扰线粒体功能直接杀伤肿瘤细胞的机制；4）阐明该过程引发的线粒体损伤如何导致mtDNA释放并进而激活cGAS-STING通路；5）在细胞和动物模型中全面验证该策略的直接肿瘤杀伤效能和系统性免疫激活效果。
第三， 详细的研究流程与方法 本研究包含了一个系统性的工作流程，从材料设计合成、表征、体外机制探究，到最终的体内疗效与安全性验证。
1. 材料设计与合成： 研究团队设计并合成了四种基于紫罗精（Viologen）的衍生物。紫罗精是缺电子分子，能够经历两步可逆的单电子还原过程形成稳定的有机自由基阳离子。为了优化其电化学性能和自由基稳定性，研究人员引入了两种策略：a) 在紫罗精的N-N‘位点引入π-共轭连接单元（二甲苯），合成了聚合物p(Dbpx-bpy)；作为对比，合成了甲基化的小分子类似物Me-bpy。b) 在紫罗精的两个吡啶环之间插入强电子受体单元噻唑并[5,4-d]噻唑，合成了TTz-Me-bpy和聚合物p(Dbpx-TTz-bpy)。插入TTz单元旨在扩展整个共轭体系，降低自由基能量，增强其稳定性。所有化合物的结构均通过核磁共振氢谱进行了确认。
2. 材料表征与性能验证： * 物理化学表征：使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认了吡啶单元和C-S键（对于含TTz的化合物）的存在。X射线光电子能谱（XPS）进一步分析了元素的组成和价态。循环伏安法（CV）测试证实了所有四种紫罗精衍生物均存在两对可逆的氧化还原峰，对应于两步单电子还原过程。结合紫外-可见吸收光谱数据和密度泛函理论计算，研究了化合物的能级和前线分子轨道分布，确认引入共轭单元和TTz有效降低了最低未占据分子轨道能量和能隙。 * 自由基生成验证：将材料溶于PBS缓冲液，施加方波交流电场（100 Hz， 3 mA， 30分钟）后，溶液颜色明显加深。电子顺磁共振（EPR）光谱直接证实了在电场刺激下，所有紫罗精衍生物均能产生自由基阳离子信号，且聚合物的信号强度显著强于其对应的小分子，表明增强共轭体系能大幅提升自由基生成能力。
3. 体外电动力学治疗评估： * 细胞毒性筛选：首先在正常小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3）上评估了四种材料（浓度高达200 μg/mL）的生物相容性，均未显示明显毒性。随后，在小鼠头颈鳞状细胞癌（SCC-7）细胞系上评估EDT效果。在没有电场时，材料本身无显著细胞毒性。但在施加方波交流电场（1 mA, 100 Hz, 12 h）后，四种化合物表现出不同程度的细胞杀伤效果，其中p(Dbpx-TTz-bpy) 效果最佳。 * 参数优化：系统研究了p(Dbpx-TTz-bpy)浓度、电场频率、电流强度和作用时间对SCC-7细胞杀伤效率的影响，确定了最优体外EDT参数为：材料浓度200 μg/mL，电场参数100 Hz， 1 mA，作用12小时。 * 细胞死亡确认：通过钙黄绿素-AM/碘化丙啶活死细胞染色和膜联蛋白V-FITC/PI流式细胞术分析，直观和定量地证实了p(Dbpx-TTz-bpy)在电场作用下能有效诱导肿瘤细胞死亡（包括早期凋亡和晚期凋亡/坏死）。
4. 线粒体损伤机制探究： * 转录组学分析：对EDT处理后的SCC-7细胞进行RNA测序，发现大量差异表达基因，其中22个与线粒体嵴损伤相关的基因表达发生显著变化，提示EDT的细胞毒性与线粒体稳态破坏密切相关。 * 线粒体靶向与膜电位丧失：共聚焦显微镜成像显示p(Dbpx-TTz-bpy)主要定位于线粒体。使用JC-1探针通过流式细胞术和荧光成像检测线粒体膜电位，发现EDT处理组线粒体膜电位显著下降（绿色单体荧光增强，红色聚合物荧光减弱）。蛋白质印迹分析显示，线粒体中的细胞色素c表达水平降低，提示其可能因膜电位崩解而释放。 * NADH耗竭与电子传递链干扰：紫外-可见光谱和定量检测发现，在电场作用下，p(Dbpx-TTz-bpy)能快速消耗细胞内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，破坏NAD+/NADH氧化还原平衡。基因集富集分析（GSEA）也证实NADH失衡相关通路基因显著富集。NAH是线粒体电子传递链的关键电子供体，其耗竭会破坏ETC功能。 * ATP合成抑制与活性氧爆发：ATP检测试剂盒显示EDT处理导致细胞内ATP水平显著降低。使用DCFH-DA探针检测活性氧，发现EDT组细胞内ROS水平急剧升高。 * 线粒体DNA损伤与释放：通过逆转录聚合酶链反应定量检测线粒体内的mtDNA含量，发现EDT处理后mtDNA含量显著减少。同时，线粒体转录因子A的荧光表达也明显下降，表明mtDNA转录受到抑制。这些结果共同表明，EDT诱导的过量ROS导致了mtDNA的氧化损伤和从线粒体向细胞质的释放。
5. cGAS-STING通路激活与体外免疫激活评估： * 通路激活验证：使用酶联免疫吸附测定检测细胞质中双链DNA含量，发现EDT组显著升高。蛋白质印迹分析显示，EDT处理提高了cGAS蛋白水平，并显著增强了STING蛋白的磷酸化，明确激活了cGAS-STING通路。 * 树突状细胞成熟：建立Transwell共培养系统，将EDT处理后的SCC-7细胞与小鼠骨髓来源的树突状细胞共培养。流式细胞术分析显示，EDT处理组的肿瘤细胞抗原能最有效地促进DC成熟（CD80+和CD86+双阳性细胞比例最高）。 * 炎症因子与损伤相关分子模式释放：ELISA检测细胞上清液，发现EDT组促炎细胞因子（IL-6， TNF-α， IL-18， IL-1β， IFN-β， IFN-γ）的分泌显著增加。同时，免疫荧光显示EDT诱导了钙网蛋白在肿瘤细胞膜上的暴露和高迁移率族蛋白B1从细胞核向胞外的释放，这是免疫原性细胞死亡的典型特征。 * 通路特异性验证：使用cGAS-STING通路的特异性激动剂（2‘3’-cGAMP）和抑制剂（C178）进行对照实验，证实EDT引发的免疫激活主要依赖于该通路的特异性激活。
6. 体内抗肿瘤疗效评估： * 皮下肿瘤模型：在携带SCC-7肿瘤的C57小鼠上，通过瘤内注射p(Dbpx-TTz-bpy)后，施加环绕式电极进行EDT治疗（参数：3 mA， 100 Hz， 30分钟）。结果显示，EDT组能显著抑制原发性肿瘤的生长，肿瘤体积和重量远低于对照组、单独电场组和单独材料组。 * 原位肿瘤模型：在小鼠乳腺脂肪垫原位种植4T1乳腺癌细胞，EDT治疗同样显示出强大的肿瘤抑制效果，肿瘤近乎完全消除。 * 组织学分析：肿瘤组织的苏木精-伊红染色显示EDT组细胞核减少、凋亡细胞增多；Ki-67染色显示细胞增殖被显著抑制；TUNEL染色显示EDT诱导了大量细胞凋亡。
7. 体内免疫激活评估： * 肿瘤微环境免疫细胞浸润：对肿瘤组织进行免疫荧光和流式细胞术分析。结果显示，EDT治疗显著增强了肿瘤内磷酸化STING的表达；促进了成熟DCs（CD11c+CD80+CD86+）的浸润；大幅增加了CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的数量；同时，CD8+IFN-γ+ 细胞毒性T细胞的比例也显著上升。 * 调节性T细胞与自然杀伤细胞：EDT治疗降低了免疫抑制性的调节性T细胞（Treg， Foxp3+）在肿瘤中的浸润，同时增加了自然杀伤细胞（NK细胞）的浸润。 * 血清炎症因子：ELISA检测小鼠血清，证实EDT组促炎细胞因子水平显著升高。 * 脾脏免疫反应：脾脏组织的流式分析也显示出与肿瘤组织一致的趋势，表明EDT引发了全身性的免疫激活。
8. 双侧肿瘤治疗与免疫记忆评估： * 远位效应：建立4T1细胞的双侧肿瘤模型，仅对原发性肿瘤进行EDT治疗。结果发现，不仅原发性肿瘤被抑制，未经处理的远处肿瘤的生长也受到显著抑制（抑制率达55.79%），且远处肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞浸润增加，证明了EDT能激发全身性抗肿瘤免疫反应（远位效应）。 * 生存获益与免疫记忆：EDT治疗显著延长了荷瘤小鼠的生存期。在肿瘤再攻击实验中，先前接受过EDT治疗并已清除肿瘤的小鼠，在再次接种同源肿瘤细胞后，表现出对肿瘤生长的强大抵抗力，且生存期延长。流式分析显示，这些小鼠脾脏中的效应记忆T细胞和中枢记忆T细胞比例显著高于对照组，表明EDT诱导了长效的抗肿瘤免疫记忆。
9. 生物相容性与安全性评估： * 生物分布与代谢：活体成像显示，材料瘤内注射后主要积聚在肿瘤和肝脏，并通过肝脏逐渐代谢清除。 * 全身毒性：治疗期间小鼠体重无显著下降。主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色未发现病理改变。血清生化指标和血常规检查无显著异常。 * 局部组织安全性：对施加电场的皮肤及皮下组织进行H&E、Masson染色以及TNF-α和IL-1β免疫组化染色，结果显示电极刺激未造成明显的组织结构破坏或急性炎症反应。
第四， 主要研究结果及其逻辑关联 本研究获得了一系列环环相扣、逻辑严密的结果： 1. 材料成功合成与性能验证结果：成功合成了四种紫罗精衍生物，并证实p(Dbpx-TTz-bpy)具有最优的电化学性能和电场刺激下产生稳定有机自由基的能力。这为后续的EDT提供了物质基础。 2. 体外高效肿瘤杀伤结果：p(Dbpx-TTz-bpy)在最优电场参数下对SCC-7细胞表现出高效的杀伤作用，且杀伤效果依赖于电场和材料的协同作用。此结果证明了该策略的直接治疗潜力。 3. 线粒体靶向与功能破坏的机制结果：材料定位于线粒体；EDT处理导致线粒体膜电位丧失、细胞色素c减少、NADH被耗竭、ATP合成抑制、ROS水平暴增。这些结果清晰地描绘出一条因果链：电场激活材料产生有机自由基 → 自由基靶向线粒体并消耗NADH → 破坏电子传递链 → 导致能量危机和ROS爆发 → 最终引发线粒体功能障碍和细胞损伤。线粒体是EDT作用的核心靶点。 4. mtDNA损伤与cGAS-STING通路激活结果：EDT引起的ROS过量积累导致了mtDNA的损伤和释放至细胞质。释放的mtDNA作为危险信号，被cGAS识别，进而激活STING及其下游磷酸化。此结果将线粒体损伤与先天性免疫通路直接联系起来，解释了EDT如何从“直接杀伤”过渡到“免疫激活”。 5. 体外免疫激活结果：激活的cGAS-STING通路促进了DC的成熟、大量促炎细胞因子的分泌，并诱导了典型的免疫原性细胞死亡标志物暴露。这证明了EDT处理后的肿瘤细胞具备了激活适应性免疫的“疫苗”样特性。 6. 体内强效抗肿瘤与免疫激活结果：在多种小鼠肿瘤模型中，EDT均表现出强大的原发性肿瘤抑制效果。深入的免疫分析证实，治疗后肿瘤微环境从“免疫抑制”向“免疫激活”转变：效应免疫细胞（DC， CD8+ T， NK）浸润增加，抑制性细胞（Treg）减少，全身炎症因子水平升高。这些结果在活体水平验证了EDT的免疫调节功能。 7. 系统性免疫与免疫记忆结果：双侧肿瘤模型中的远位效应和肿瘤再攻击实验中的保护作用，是证明EDT能激发真正、持久、系统性抗肿瘤免疫力的最有力证据。这超越了局部治疗的概念，为抑制肿瘤转移和复发提供了可能。
第五， 研究的结论、意义与价值 本研究的结论是：成功开发了一种基于电针驱动、线粒体靶向的聚合紫罗精自由基发生平台，该平台能够通过氧气非依赖性的有机自由基介导的电动力学疗法，有效杀伤肿瘤细胞；同时，通过诱导线粒体损伤和mtDNA释放，特异性激活cGAS-STING先天性免疫通路，从而协同引发强大的直接杀伤和系统性抗肿瘤免疫反应，实现对原发性及转移性肿瘤的高效抑制，并诱导长效免疫记忆。 该研究的科学价值在于：1）提出并验证了“有机自由基EDT”这一新颖的治疗模式，为克服实体瘤缺氧微环境对自由基疗法的限制提供了全新思路。2）首次将有机自由基的生成、线粒体靶向干扰、mtDNA泄漏和cGAS-STING通路激活串联成一个清晰完整的“直接杀伤-免疫启动”协同作用机制。3）拓展了紫罗精类材料在生物医学，特别是肿瘤治疗领域的应用。 其应用价值潜力巨大：1）为临床肿瘤治疗，尤其是对传统放疗、化疗、PDT不敏感的缺氧性实体瘤，提供了一种潜在的替代或辅助治疗方案。2）所采用的针电极EDT系统具有成本低、操作简便、微创和靶向性好的特点，易于与现有临床技术（如电穿孔、射频消融）结合或转化。3）所激发的系统性免疫和记忆效应，为抑制术后复发和转移带来了希望。
第六， 研究亮点 1. 方法学创新：首次提出并实现了“电针激活的有机自由基EDT”概念。与依赖氧气的传统自由基疗法相比，该方法从根本上摆脱了肿瘤