一项关于HBV编码的环状RNA促进肝癌进展机制的重要研究成果
本研究的通讯作者为Jianmin Wang（邮箱：wangjm8605@163.com）与Jingfeng Liu（邮箱：drjingfeng@126.com），第一作者为Yong Yang与Yongshi Shen。作者团队主要来自中国福建省，所属单位包括福建医科大学临床肿瘤学院、福建省肿瘤医院创新癌症研究中心、福建省肿瘤筛查与早期诊断重点实验室、福建省肿瘤医院重症监护室、福州大学生物科学与工程学院以及福建省肿瘤医院肝胆胰外科。这项原创性研究于2025年9月5日在线发表在微生物学领域的学术期刊《Microbiology Spectrum》上，具体为2025年10月刊第13卷第10期，文章识别码为10.1128/spectrum.01439-25。
一、 研究背景与目的
本研究隶属于分子肿瘤学与病毒学交叉领域，聚焦于乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus， HBV）相关性肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma， HCC）的发病机制。尽管新生儿乙肝疫苗有效阻断了HBV传播，但全球仍有数千万慢性HBV感染者面临肝病乃至肝癌的风险。HBV是导致中国肝硬化和HCC的首要原因，每年导致约19万例HCC。传统的观点认为，HBV主要通过其编码的蛋白（如HBx）以及病毒基因组整合入宿主基因组等方式促进肝癌发生。然而，随着高通量测序技术的发展，非编码RNA（non-coding RNA）在肿瘤发生中的作用日益受到重视。其中，环状RNA（circular RNA， circRNA）是一类新近发现的、具有共价闭合环状结构的非编码RNA，比线性RNA更稳定，在多种生物学过程和癌症（包括HCC）中扮演重要角色。
此前有生物信息学预测表明，HBV可能编码多达5种不同的circRNA，但其在HBV相关肝癌发生中的具体功能尚不清楚。仅有零星研究开始探索，例如Zhu等人发现HBV_circ_1可通过上调CDK1促进HCC发生。Hippo信号通路在器官发育、稳态维持和肿瘤发生中至关重要，其下游关键效应因子YAP/TAZ的失调与多种癌症密切相关。一些研究也发现某些circRNA参与调控YAP/TAZ的表达。在此背景下，本研究旨在深入探究一种特定的HBV编码的circRNA（根据预测命名为HBV-circRNA-5）是否以及如何参与HBV相关HCC的进展。研究目标包括：1）在HBV阳性HCC组织和细胞中验证HBV-circRNA-5的存在与特性；2）探究HBV-circRNA-5对HCC细胞增殖、迁移、侵袭等恶性表型的影响；3）在动物模型中验证其促肿瘤作用；4）阐明HBV-circRNA-5发挥作用的分子机制，特别是其是否作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA， ceRNA）通过吸附微小RNA（microRNA， miRNA）来调控下游信号通路。
二、 详细研究流程与方法
本研究流程系统，从分子鉴定到功能验证，再到机制探索，层层递进。
第一部分：HBV-circRNA-5的鉴定与特性分析。 研究首先在HBV相关的HCC临床组织样本和能持续产生HBV的细胞系HepG2.2.15中，验证HBV-circRNA-5的存在。研究者从福建省肿瘤医院获取了经临床确诊的HBV阳性HCC患者的组织样本（具体样本量未在材料方法部分明确给出，但在图1a中显示至少有2例HBV阳性组织用于检测）。研究使用针对HBV-circRNA-5环化拼接位点设计的特异性引物（Splice Junction Overlapping Divergent primers）进行逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），成功扩增出目标片段，并通过Sanger测序证实了预期的环化序列（图1a, b）。为了明确其亚细胞定位，研究进行了荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization， FISH）和细胞组分分离实验，结果一致显示HBV-circRNA-5主要定位于细胞质中（图1c, d）。此外，研究用RNase R处理RNA，发现HBV-circRNA-5比线性的HBV mRNA更能抵抗降解，证明了其环状结构的稳定性（图1e）。这部分工作确认了HBV-circRNA-5在HBV相关HCC中稳定存在，为后续功能研究奠定了基础。
第二部分：HBV-circRNA-5在体外对HCC恶性表型的功能研究。 研究采用功能获得（gain-of-function）和功能缺失（loss-of-function）两种策略。首先，在HBV阳性的HepG2.2.15细胞中，使用靶向HBV-circRNA-5拼接位点的小干扰RNA（siRNA）进行敲低。通过RT-qPCR验证敲低效率后（图2a），进行了一系列功能实验：细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验检测细胞增殖活性（图2c）；平板克隆形成实验评估细胞长期增殖和自我更新能力（图2b）；5-乙炔基-2‘脱氧尿嘧啶核苷（EdU）掺入实验直接检测处于DNA合成期的细胞比例（图2d）。结果表明，敲低HBV-circRNA-5显著抑制了HepG2.2.15细胞的增殖能力。在功能获得性实验中，研究者将HBV-circRNA-5的全长序列构建到表达载体中，转染至HCC细胞系（如SMMC-7721和HepG2）使其过表达。同样通过CCK-8实验（图3a）、平板克隆形成实验（图3b）和EdU实验（图3c）证实，过表达HBV-circRNA-5能显著促进HCC细胞的增殖。此外，Transwell小室实验（包括不铺Matrigel的迁移实验和铺Matrigel的侵袭实验）显示，过表达HBV-circRNA-5能显著增强HCC细胞的迁移和侵袭能力（图3d）。
第三部分：HBV-circRNA-5作为miR-9-3p海绵的机制验证。 为了探索HBV-circRNA-5发挥作用的分子机制，研究者假设其可能作为ceRNA吸附特定的miRNA。他们利用病毒环状RNA数据库（VirusCircBase）进行预测，发现HBV-circRNA-5可能结合多个miRNA，其中包括在HCC中已被报道起肿瘤抑制作用的miR-9-3p。RNAhybrid软件进一步预测了二者具体的结合位点（图4a）。为验证这一相互作用，研究进行了双荧光素酶报告基因实验：将含有HBV-circRNA-5野生型序列（circRNA5-wt）或结合位点突变序列（circRNA5-mut）的片段插入报告基因载体pmirGLO，然后与miR-9-3p mimics共同转染HEK-293T细胞。结果显示，与对照组相比，共转染circRNA5-wt和miR-9-3p的组别荧光素酶活性显著降低，而突变组则无此效应，证实了二者之间存在特异性结合（图4b）。此外，在过表达HBV-circRNA-5的HCC细胞中，检测到内源性miR-9-3p的表达水平显著下降，这符合ceRNA“海绵”吸附并降低miRNA水平的表现（图4c）。功能回复实验进一步支持了这一机制：当过表达HBV-circRNA-5的同时，共转染miR-9-3p mimics，可以逆转HBV-circRNA-5对HCC细胞增殖的促进作用（图4d, e）。值得注意的是，研究还构建了结合位点突变的HBV-circRNA-5（circRNA5-mut）进行过表达，发现其促增殖能力较野生型有所减弱但依然存在，提示HBV-circRNA-5可能还通过其他靶点或机制调控细胞生长（图4f）。
第四部分：HBV-circRNA-5通过miR-9-3p调控Hippo通路。 既然确定了miR-9-3p是靶点，而既往文献表明miR-9-3p可通过靶向WWTR1（TAZ）抑制Hippo通路，研究团队接下来探索了HBV-circRNA-5/miR-9-3p轴是否通过调控Hippo通路下游效应因子YAP/TAZ来发挥作用。首先，在HCC细胞中转染miR-9-3p mimics，Western Blot检测显示YAP和TAZ的蛋白表达水平确实显著降低（图5a）。反之，在过表达HBV-circRNA-5的HCC细胞中，YAP和TAZ蛋白水平明显上调（图5b）；而在敲低HBV-circRNA-5的HepG2.2.15细胞中，YAP/TAZ蛋白水平则下降（图5c）。更重要的是，在过表达HBV-circRNA-5的同时共转染miR-9-3p mimics，可以逆转HBV-circRNA-5对YAP/TAZ蛋白的上调作用（图5d）。最后，研究使用YAP/TAZ抑制剂-1（YTI）处理过表达HBV-circRNA-5的HCC细胞，CCK-8实验表明，YTI能有效减弱HBV-circRNA-5对细胞增殖的促进作用（图5e）。这些结果形成了完整的证据链，表明HBV-circRNA-5通过吸附miR-9-3p，解除其对YAP/TAZ的抑制，从而激活Hippo信号通路，促进HCC进展。
第五部分：HBV-circRNA-5在体内促进肿瘤生长的验证。 为了在更接近生理环境的条件下验证HBV-circRNA-5的促癌功能，研究进行了动物实验。研究者构建了稳定过表达HBV-circRNA-5的Hep3B细胞系，将等量的对照细胞和过表达细胞分别皮下注射到BALB/c裸鼠体内（每组3只小鼠，每只注射1×10^7个细胞）。定期观察并测量肿瘤体积，待肿瘤体积达到约2000 mm³时处死小鼠，取出肿瘤并称重。结果显示，过表达HBV-circRNA-5组小鼠的皮下移植瘤在体积和重量上都显著大于对照组（图6a-c），在体内水平证实了HBV-circRNA-5的促肿瘤生长作用。
三、 主要研究结果及其逻辑关联
本研究的主要结果环环相扣，逻辑严密： 1. 鉴定结果：成功在HBV阳性HCC组织和HepG2.2.15细胞中检测到稳定存在的HBV-circRNA-5，其定位于细胞质，具有环状RNA的典型特征（抗RNase R降解）。这回答了“它是否存在”的问题，是后续所有研究的起点。 2. 功能表型结果：体外实验表明，降低HBV-circRNA-5抑制HCC细胞增殖，而过表达则促进增殖、迁移和侵袭。体内实验进一步证实过表达能加速裸鼠皮下瘤生长。这些结果直接证明了HBV-circRNA-5具有促癌基因的功能，回答了“它有什么作用”的问题。 3. 分子互作结果：双荧光素酶报告基因实验和表达调控实验证实HBV-circRNA-5能直接结合并负调控miR-9-3p。功能回复实验显示miR-9-3p可逆转HBV-circRNA-5的促增殖效应。这揭示了其发挥作用的上游分子机制，即作为miRNA海绵，回答了“它如何起作用的第一步”。 4. 信号通路结果：系列蛋白检测实验证实，miR-9-3p能抑制YAP/TAZ表达，而HBV-circRNA-5通过吸附miR-9-3p解除这种抑制，从而导致YAP/TAZ上调。使用YAP/TAZ抑制剂能阻断HBV-circRNA-5的促增殖作用。这阐明了其作用的最终下游效应通路，即激活Hippo通路，完整回答了“它通过什么通路起作用”。
从鉴定到功能，再到机制（ceRNA网络和信号通路），最后在体内验证，结果之间层层递进，证据链完整。
四、 研究结论与价值
本研究得出的核心结论是：HBV编码的环状RNA——HBV-circRNA-5，在HBV相关肝细胞癌中稳定表达，并通过充当miR-9-3p的分子海绵，解除miR-9-3p对Hippo信号通路关键效应因子YAP/TAZ的抑制，从而激活该通路，最终驱动HCC的增殖、迁移、侵袭和体内肿瘤生长。
其科学价值在于： 1. 揭示了HBV致癌的新机制：突破了以往主要关注HBV蛋白（如HBx）和基因组整合的传统视角，首次深入系统地阐明了HBV编码的circRNA（HBV-circRNA-5）通过ceRNA机制调控宿主关键信号通路促进肝癌进展的完整分子轴线（HBV-circRNA-5/miR-9-3p/Hippo-YAP/TAZ）。 2. 拓展了对病毒circRNA功能的认识：为病毒来源的circRNA参与疾病（特别是癌症）发生发展提供了强有力的实验证据，丰富了病毒与宿主相互作用的调控网络。 3. 为HCC治疗提供了新的潜在靶点：HBV-circRNA-5作为一个病毒来源的、在HBV相关HCC中特异性存在的分子，理论上具有比宿主分子更好的靶向特异性，可能成为未来开发新型靶向治疗药物或预后标志物的有潜力的候选分子。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的讨论与局限性
作者在讨论部分也坦诚地指出了本研究的潜在局限性，这体现了科学思维的严谨性： 1. 基因型普适性问题：本研究使用的HBV-circRNA-5序列、细胞系HepG2.2.15均基于HBV基因型D。而不同HBV基因型（如亚洲常见的B型和C型）在致病性上可能存在差异。因此，该机制在其他HBV基因型（特别是与肝癌关系更密切的C型）中是否普遍适用，需要后续研究验证。 2. 脱靶效应与机制复杂性：研究者注意到，即使破坏了与miR-9-3p的结合，突变的HBV-circRNA-5仍保留部分促增殖能力。这提示HBV-circRNA-5可能还存在其他靶向miRNA或非ceRNA机制（如与RNA结合蛋白相互作用），其促癌作用可能是多靶点、多通路协同的结果。这为未来更深入的研究指明了方向。
这项研究是一项系统、深入且具有重要启示意义的原创性工作，极大地增进了我们对HBV如何通过其编码的非编码RNA分子劫持宿主细胞信号通路进而导致肝癌的理解。