本研究由王晓成（Xiaocheng Wang）、吕芳（Fang Lv）、李甜（Tian Li）、韩一鸣（Yiming Han）、易正芳（Zhengfang Yi）、刘明耀（Mingyao Liu）、常江（Jiang Chang）及吴成铁（Chengtie Wu）等人完成。其中，王晓成、李甜和常江、吴成铁来自中国科学院上海硅酸盐研究所高性能陶瓷与超微结构国家重点实验室；王晓成和李甜同时隶属于中国科学院大学；吕芳、韩一鸣、易正芳和刘明耀来自华东师范大学生命科学学院生物医学研究所上海市调控生物学重点实验室。通讯作者为吴成铁。该研究于2017年10月23日被ACS Nano接收并在线发表，论文发表于ACS Nano 2017年第11卷，页码为11337–11349，DOI为10.1021/acsnano.7b05858。
皮肤组织是人体重要的外周感受器和外部环境防护屏障。皮肤癌是目前人类最常见的恶性肿瘤之一，每年新发病例超过一百万例。针对皮肤癌的治疗，手术切除仍然是临床上应用最广泛且首选的治疗方式。然而，手术切除往往难以将肿瘤组织完全清除，残余的微小肿瘤病灶可能导致肿瘤复发；与此同时，手术造成的皮肤缺损还面临二期愈合的难题。传统策略难以同时满足“清除残余肿瘤”和“促进皮肤组织再生”的双重临床需求。因此，开发一种兼具肿瘤治疗能力和皮肤组织再生功能的多功能生物材料成为迫切需要解决的问题。
光热治疗（photothermal therapy，PTT）作为一种非侵入性或微创的肿瘤治疗手段，近年来在多种肿瘤治疗中得到广泛探索。其中，近红外（near-infrared，NIR，波长700–1100 nm）光热转换剂（photothermal agent，PTA）由于近红外光在生物组织中具有数厘米的穿透深度而备受关注。半导体硫化亚铜（Cu₂S）纳米颗粒因其本征的近红外吸收和高效的光热转换能力，被认为是一类有前景的光热转换剂。然而，粉末状态的纳米颗粒直接应用于肿瘤切除后的创面时，容易从创口脱落，还可能因与创面直接接触而诱发炎症反应，导致离子不受控制地释放，从而限制其在组织再生中的应用。因此，将光热转换剂与组织修复策略整合在同一平台中是解决上述问题的重要方向。
电纺膜（electrospun membranes）在组织工程中应用广泛，其微结构可通过电纺工艺灵活调控，具有类似细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的结构、高比表面积和良好的生物相容性，能够为细胞黏附、迁移和增殖提供力学支撑及生物学刺激。聚（D,L-乳酸）（poly(D,L-lactic acid)，PDLLA）与聚（ε-己内酯）（poly(ε-caprolactone)，PCL）组成的共混电纺膜已被证明具有可调控的结构和良好的生物活性。此外，铜离子（Cu²⁺/Cu⁺）已被报道能够刺激内皮细胞增殖和血管新生，因此Cu₂S纳米颗粒除光热效应外，其释放的铜离子也可能具有促进创面愈合的潜力。然而，此前关于Cu₂S纳米颗粒的研究主要集中在其光热性能用于肿瘤治疗，尚无利用Cu₂S纳米颗粒进行组织再生的报道。
基于上述背景，本研究旨在通过将Cu₂S纳米花（nanoflowers）整合至微图案化（micropatterned）电纺聚合物纤维中，构建一种同时具备光热肿瘤治疗能力和皮肤组织再生能力的双功能纳米复合膜（CS-PLA/PCL膜），用于治疗皮肤肿瘤切除后形成的皮肤缺损，并在同一平台上实现肿瘤清除和创面愈合。
本研究的主要流程包括：Cu₂S纳米花的合成与表征、微图案化CS-PLA/PCL膜的制备与结构表征、光热性能测试、体外抗肿瘤实验、体内抗肿瘤实验、体外皮肤细胞生物活性实验以及体内糖尿病创面愈合实验。
Cu₂S纳米颗粒通过水热法制备。将Cu(NO₃)₂·3H₂O、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）溶于去离子水，于40 °C搅拌形成均匀溶液后，转入特氟龙内衬不锈钢高压釜中，在120 °C加热24 h。所得黑色产物经去离子水和乙醇洗涤、离心、研磨并真空干燥。扫描电子显微镜（SEM）观察显示所得颗粒直径为200–600 nm，呈由大量超薄纳米片构成的海绵状结构。X射线衍射（XRD）结果与蓝辉铜矿（digenite）Cu₂S晶相（JCPDS No. 02-1294）匹配良好。X射线光电子能谱（XPS）测得Cu 2p3/2和Cu 2p1/2结合能分别为932.4 eV和952.1 eV，与Cu₂S标准值一致，且不存在Cu(II)物种。电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）测得Cu/S原子比为1.92，接近Cu₂S的化学计量比。
将PDLLA和PCL以等质量比溶解于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）与四氢呋喃（THF）混合溶剂中，通过超声处理将不同质量比的Cu₂S纳米颗粒（相对聚合物质量的0、10、20、30、40和50 wt%）分散至聚合物溶液中形成稳定悬浮液，再通过改进的电纺工艺制备微图案化膜。收集器为孔径300 μm的不锈钢网。不同Cu₂S含量的膜分别命名为0CS-PLA/PCL、10CS-PLA/PCL、20CS-PLA/PCL、30CS-PLA/PCL、40CS-PLA/PCL和50CS-PLA/PCL膜。SEM结果显示，所有CS-PLA/PCL膜均具有约300 μm孔隙的图案化多孔结构，纤维直径随Cu₂S含量增加而由约1200 nm逐渐降低至200 nm。透射电子显微镜（TEM）和高角度环形暗场扫描电子显微镜（HAADF-SEM）结合能量色散谱（EDS）元素分布图显示，Cu₂S颗粒在膜整体中分布分散，EDS谱中出现Cu和S的特征峰，证实Cu₂S成功包埋于纤维膜中。
将CS-PLA/PCL膜在干燥（空气）和湿润（500 μL磷酸盐缓冲液，PBS）条件下暴露于808 nm激光（功率密度0.50 W·cm⁻²）照射5或10 min，利用红外热成像系统实时记录温度变化和热像。结果显示，30CS-PLA/PCL膜在干燥条件下5 min内升温至约61 °C，在湿润条件下10 min内升至约52 °C；而0CS-PLA/PCL膜在相同条件下无明显升温（32 °C和30 °C）。40CS-和50CS-PLA/PCL膜在干燥条件下照射后因温度高达约65 °C而严重变形，而30CS-PLA/PCL膜在60 °C以上仍可保持较好的大孔图案结构。在PBS中，通过调节激光功率密度（0.20–0.80 W·cm⁻²）和Cu₂S含量，CS-PLA/PCL膜可实现在室温至62 °C范围内的可控光热升温。此外，将膜浸泡于细胞培养基3天后，其光热升温能力无明显衰减；将30CS-PLA/PCL膜置于不同厚度（1–11 mm）猪肉组织一侧并照射，对侧温度随组织深度增加而降低，在1 mm、3 mm、5 mm、7 mm、9 mm和11 mm厚度时分别达到约54.7、50.6、47.2、43.1、40.4、36.8和33.5 °C，说明光热效应可穿透一定深度组织。
使用小鼠B16F10黑色素瘤细胞和人A375黑色素瘤细胞作为体外肿瘤模型。将细胞接种于0CS-或30CS-PLA/PCL膜上，并经808 nm激光（0.50 W·cm⁻²）照射15 min。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察细胞骨架和细胞核；活/死细胞染色观察细胞膜完整性；CCK-8法测定细胞活力。实验设置0CS-PLA/PCL膜、30CS-PLA/PCL膜、0CS-PLA/PCL膜+激光、30CS-PLA/PCL膜+激光四组。结果显示，30CS-PLA/PCL膜+激光组中B16F10和A375细胞活力分别降至26.4%和23.1%，显著低于其他对照组；且随着光热温度升高（37–57 °C）、照射次数增加（1–3次）和照射时间延长（5–20 min），细胞活力进一步降低至6.3%–14.7%。激光照射的30CS-PLA/PCL膜所致高温可有效杀死膜上及邻近的皮肤肿瘤细胞。
建立BALB/c小鼠B16F10皮下肿瘤模型（每只注射2×10⁶个细胞），待肿瘤体积约70 mm³后，在肿瘤部位创建直径10 mm全层皮肤缺损，将0CS-或30CS-PLA/PCL膜覆盖创面，并用808 nm激光（0.40 W·cm⁻²，15 min，每天1次，连续4天）照射。实验分为对照组、单纯激光组、0CS-PLA/PCL组、30CS-PLA/PCL组、0CS-PLA/PCL+激光组和30CS-PLA/PCL+激光组，每组5只。利用红外热像记录肿瘤表面温度。结果显示，30CS-PLA/PCL+激光组温度迅速超过50 °C，而激光组和0CS-PLA/PCL+激光组仅约41 °C。治疗4天后，30CS-PLA/PCL+激光组肿瘤体积明显缩小，14天内肿瘤逐渐消失且无复发，原伤口完全愈合；其他五组肿瘤持续增长。肿瘤重量在该组中最轻。组织学分析显示，该组肿瘤组织中Ki67表达显著降低，H&E染色显示大部分细胞坏死，TUNEL染色显示大量细胞凋亡，证实光热治疗通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导混合性坏死/凋亡抑制肿瘤生长。
使用人皮肤成纤维细胞（HDFs）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）评价膜的体外再生活性。HDFs接种于0CS-或30CS-PLA/PCL膜上24 h后，SEM和CLSM观察显示细胞在两种膜上铺展良好、黏附紧密。CCK-8结果显示，与对照组相比，0CS-和30CS-PLA/PCL膜在培养5天后均显著促进HDFs增殖。划痕实验（scratch assay）显示，HUVECs在30CS-PLA/PCL组培养6 h后划痕几乎完全闭合，相对创面面积降至5.1%，显著低于对照组（28.1%）和0CS-PLA/PCL组（18.4%），说明30CS-PLA/PCL膜可显著促进内皮细胞迁移。铜离子释放检测显示，30CS-PLA/PCL膜在培养基中第1天释放铜离子浓度为0.497 μg·mL⁻¹，第4天累积浓度为0.780 μg·mL⁻¹。此外，HUVECs在激光照射的30CS-PLA/PCL膜上细胞活力显著下降至40.8%，提示正常皮肤细胞也可被近红外诱导的热量杀伤。
为排除肿瘤生长对创面愈合的干扰，使用链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病C57BL/6小鼠模型评价膜本身的创面愈合效果。将小鼠随机分为对照组、0CS-PLA/PCL组和30CS-PLA/PCL组，每组8只。在背部创建直径10 mm全层皮肤缺损，覆盖膜后用Tegaderm固定。结果显示，第8天后30CS-PLA/PCL组创面面积显著小于其他两组，第12天剩余创面面积分别为对照组28.9%、0CS-PLA/PCL组25.5%、30CS-PLA/PCL组13.6%。血管观察和CD31免疫荧光染色结果显示，30CS-PLA/PCL组创面床中血管网络明显增多，CD31阳性血管比例（138.6%）显著高于0CS-PLA/PCL组（74.8%）和对照组（100%），表明30CS-PLA/PCL膜可促进糖尿病创面血管新生和愈合。
本研究成功制备了Cu₂S纳米花复合的微图案化PDLLA/PCL电纺膜。Cu₂S颗粒均匀分散在聚合物纤维中，膜保持约300 μm的图案化大孔结构。30CS-PLA/PCL膜在808 nm激光照射下表现出快速、可控的光热升温能力，在湿润条件下可升至52–62 °C，而0CS-PLA/PCL膜无光热效应。体外实验中，该膜在近红外激光照射下可有效杀死B16F10和A375皮肤黑色素瘤细胞，细胞活力最低可降至6.3%，且通过调节温度、照射次数和持续时间可实现可控的抗肿瘤效果。体内实验中，30CS-PLA/PCL膜在激光照射下可抑制B16F10肿瘤生长，14天内肿瘤消失且无复发，组织学证实其通过抑制增殖和诱导坏死/凋亡发挥抗肿瘤作用。在创面愈合方面，30CS-PLA/PCL膜能够促进HDFs黏附和增殖，加速HUVECs迁移，并通过释放适量铜离子促进血管新生；在糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型中，该膜显著加速创面闭合和提高CD31阳性血管密度。
本研究提出并验证了一种将光热治疗与组织再生整合于单一平台的策略。通过将Cu₂S纳米花包埋入微图案化PDLLA/PCL电纺纤维膜，构建了兼具近红外光热肿瘤治疗能力和皮肤组织再生促进作用的双功能纳米复合膜。该膜在体外可高效杀伤皮肤肿瘤细胞，在体内可抑制肿瘤生长并促进糖尿病创面愈合。该研究为局部皮肤肿瘤治疗和肿瘤切除后创面修复提供了一种简便、可靠的策略，在肿瘤诱导的创面愈合应用中具有广阔前景。
本研究的亮点主要体现在以下方面：第一，首次将Cu₂S纳米颗粒的光热效应与铜离子的血管新生促进作用相结合，在同一膜平台上同时实现肿瘤治疗和创面愈合；第二，通过微图案化电纺技术成功将Cu₂S纳米花均匀包埋于PDLLA/PCL纤维中，实现了可控的光热升温，同时保持了良好的结构完整性；第三，系统评价了不同Cu₂S含量、激光功率、照射时间和次数对光热抗肿瘤效率的影响，为临床参数优化提供了实验依据；第四，利用糖尿病小鼠全层皮肤缺损模型排除了肿瘤生长对创面愈合的干扰，单独证实了膜本身的创面愈合和血管新生促进作用，增强了结论的可靠性。