氢氘交换质谱（HDX-MS）及其他质谱技术在表位（epitope）定位中的应用综述

作者及机构
本文由Prashant N. Jethva和Michael L. Gross*（通讯作者）共同完成，两位作者均来自美国圣路易斯华盛顿大学（Washington University in St. Louis）化学系。论文于2023年5月18日发表在期刊《Frontiers in Analytical Science》上，题为《Hydrogen Deuterium Exchange and Other Mass Spectrometry-Based Approaches for Epitope Mapping》。

主题与背景
本文是一篇系统性综述，聚焦于质谱技术（尤其是氢氘交换质谱，HDX-MS）在抗原-抗体相互作用表位定位（epitope mapping）中的应用。抗原-抗体相互作用是免疫系统的核心机制，表位（抗原上与抗体结合的区域）的精准定位对抗体药物开发、疫苗设计及疾病治疗至关重要。传统高分辨率结构技术（如X射线晶体学、冷冻电镜和核磁共振）虽能提供原子级细节，但存在耗时、通量低、灵敏度不足等局限。相比之下，质谱技术凭借快速分析、中等结构分辨率及无抗原大小限制等优势，成为表位定位的重要工具。

主要观点与论据

1. 表位定位的技术需求与挑战
   抗原表位可分为线性表位（连续氨基酸序列）和构象表位（由空间邻近但不连续的残基组成）。大多数抗体靶向构象表位，需在天然状态下定位，这增加了技术难度。传统方法如肽库扫描（pepscan）和噬菌体展示（phage display）仅适用于线性表位，而HDX-MS能同时解析两类表位。作者指出，质谱技术的核心优势在于其能捕捉溶液状态下的动态相互作用，且适用于大分子复合物（如病毒颗粒）。

2. HDX-MS的原理与流程
   HDX-MS通过监测抗原在氘代缓冲液中的氢氘交换动力学差异来定位表位。抗体结合会保护表位区域的酰胺氢交换，从而在质谱中显示为氘掺入减少。具体流程包括：

   • 样品制备：抗原与抗体在生理条件下孵育形成复合物。
     
   • 氘代标记：将复合物与游离抗原分别稀释于D₂O中，在不同时间点淬灭（pH 2.6，0°C）。
     
   • 酶解与分离：使用酸性蛋白酶（如胃蛋白酶pepsin）在线消化，通过液相色谱（LC）分离肽段。
     
   • 质谱分析：比较复合物与游离抗原的氘掺入差异，定位保护区域。
     作者强调，多酶联用（如胃蛋白酶与真菌蛋白酶）可提高序列覆盖率和空间分辨率，而低温色谱（-30°C）能减少氘回换（back exchange），提升数据质量。

3. HDX-MS的技术进展

   • 气体相碎片化（ETD/ECD）：电子转移解离（ETD）和电子捕获解离（ECD）可避免碰撞诱导解离（CID）导致的氘原子重排，实现残基级分辨率。例如，研究TL1A抗体时，ETD将表位从15个氨基酸的肽段精确定位至4个关键残基（113-116和169-172）。
     
   • 自动化与低温色谱：自动化平台（如LEAP PAL机器人）和亚零度色谱（-30°C）将梯度时间延长至90分钟，显著提升肽段检测数量。
     
   • 二硫键还原与糖基化处理：在线电化学还原（EC）和酸兼容糖苷酶（如PNGase DJ）解决了复杂抗原（如高度糖基化的病毒蛋白）的序列覆盖难题。

4. 互补技术的整合

   • 共价标记（如FPOP）：快速光化学氧化蛋白质（FPOP）通过羟基自由基（·OH）标记表面残基，与HDX-MS的骨架动态数据互补。例如，在IL-23抗体研究中，FPOP揭示了色氨酸（W29）和蛋氨酸（M35）的侧链接触，而HDX-MS定位了骨架保护区域。
     
   • 交联质谱（XL-MS）：如PD-1抗体研究中，交联距离约束辅助分子对接，验证了HDX-MS发现的FG环表位。
     

5. 应用案例与验证

   • 病毒抗原研究：登革热病毒（DENV）颗粒的HDX-MS揭示了温度依赖性构象变化，抗体2D22通过靶向E蛋白二聚体界面抑制病毒膜融合。
     
   • 治疗性抗体开发：抗IL-23抗体7b7的表位通过HDX-MS、FPOP和丙氨酸扫描（alanine scanning）三重验证，确认了M35和L97为关键结合残基。
     

论文价值与意义
本文系统梳理了HDX-MS在表位定位中的技术优势与最新进展，强调了多技术联用（如HDX-ETD-MS、FPOP、XL-MS）对复杂表位解析的重要性。其科学价值在于：
1. 方法学创新：提出了低温色谱、多酶消化等优化策略，解决了大分子复合物的分析难题。
2. 应用指导：为抗体药物开发（如癌症免疫治疗）和疫苗设计提供了高效的结构生物学工具。
3. 理论贡献：阐明了抗原-抗体相互作用的动态本质，弥补了静态结构技术的不足。

亮点总结
- 技术全面性：覆盖从传统HDX-MS到前沿的ETD/ECD碎片化、亚零度色谱及自动化流程。
- 跨学科整合：融合质谱、结构生物学与计算建模（如分子对接），推动表位定位进入残基级精度时代。
- 临床相关性：案例涉及SARS-CoV-2、癌症免疫检查点等热门靶点，凸显技术的转化潜力。

本文为研究者提供了HDX-MS在表位定位中的“最佳实践”指南，并展望了其在个性化医疗和病原体防控中的未来应用。