单细胞与批量RNA测序联用揭示CXCR4基因在胃癌生长转移中的调控作用

作者及发表信息
本研究由徐州医科大学附属徐州市肿瘤医院的Hongying Zhao（通讯作者）、Rongke Jiang团队与江苏大学Chunmei Zhang、Zhijing Feng、Xue Wang合作完成，发表于《npj Precision Oncology》2023年第7卷。DOI: 10.1038/s41698-023-00436-2。

学术背景
胃癌（Gastric Cancer, GC）具有高度分子和表型异质性，其快速进展、远处转移和化疗耐药性与肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）密切相关。CSCs是肿瘤起始、复发和转移的关键驱动因素，但其分子机制尚未完全阐明。CXCR4（C-X-C趋化因子受体4型）作为CSCs标志基因，在多种癌症中参与转移调控，但在胃癌中的作用机制仍需深入探索。本研究联合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和批量RNA测序（bulk RNA-seq），旨在揭示CXCR4在胃癌CSCs中的功能及其临床预后价值。

研究方法与流程
1. 数据获取与预处理
- 数据来源：从GEO数据库下载7例胃癌scRNA-seq数据（3例原位肿瘤、2例淋巴结转移、2例肝转移），UCSC Xena数据库获取TCGA-STAD和GTEx的bulk RNA-seq数据（375例肿瘤、32例正常组织）。
- 质量控制：使用Seurat包过滤低质量细胞（线粒体基因占比<10%，RNA计数1000-20000），通过PCA和UMAP降维分析细胞异质性。
- 恶性上皮细胞筛选：通过inferCNV分析拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV），结合k-means算法排除非恶性细胞，获得1314个恶性上皮细胞。

1. CSCs亚群鉴定

   • 聚类分析：恶性上皮细胞分为C1-C4四类，其中C4细胞群位于伪时间轨迹起始端，干细胞评分（基于CXCR4、CD44等标志物）显著高于其他亚群（p<0.001）。
     
   • 功能富集：C4细胞标志基因富集于核分裂、染色体分离等生物学过程，以及与TNF信号通路相关的癌症通路。
     

2. CXCR4功能验证

   • 临床关联：TCGA数据分析显示，CXCR4高表达与患者不良预后显著相关（p=0.008）。
     
   • 体外实验：流式分选CD44+ MKN45细胞（CSCs模型），敲低CXCR4后，细胞增殖、迁移和侵袭能力均显著下降（Transwell实验显示迁移细胞数减少50%以上，p<0.01）。
     
   • 体内实验：裸鼠皮下成瘤及尾静脉肝转移模型中，CXCR4敲低组肿瘤体积和肝转移结节数显著减少（p<0.05），小鼠体重增加。
     

主要结果
1. 异质性解析：scRNA-seq揭示胃癌组织中存在19个细胞亚群，C4亚群（CXCR4+CD44+）具有CSCs特性，且与EMT（上皮-间质转化）标志物表达呈正相关（Spearman ρ=0.28, p=2.83e-08）。
2. 预后标志物：CXCR4在胃癌组织中过表达（TCGA数据p<2.22e-16），高表达患者5年生存率降低25%（p=0.008）。
3. 机制验证：CXCR4通过调控CSCs的自我更新和EMT进程促进转移，其 knockdown 可抑制裸鼠肿瘤生长和肝转移（肝结节数减少60%，p<0.01）。

研究结论
CXCR4是驱动胃癌CSCs恶性表型的关键基因，通过增强EMT和转移能力促进肿瘤进展。该研究为胃癌预后预测和靶向CSCs的治疗策略提供了新靶点。

研究亮点
1. 技术创新：首次联合scRNA-seq与bulk RNA-seq解析胃癌CSCs的转录异质性，结合inferCNV算法精准筛选恶性细胞。
2. 临床价值：明确CXCR4作为独立预后标志物的潜力，为抗转移治疗提供理论依据。
3. 机制深度：从单细胞层面揭示CXCR4调控CSCs干性维持和EMT的动态过程，补充了胃癌转移的分子图谱。

其他发现
CXCR4与肿瘤微环境中免疫细胞（如TAMs）的互作可能通过细胞因子（如TGF-β）进一步促进转移，未来可探索联合免疫治疗的可行性。