本文件是《Immunogenetics: Methods and Protocols》一书中的第13章，章节标题为“Gene engineering T cells with T-cell receptor for adoptive therapy”，由Dian Kortleve、Mandy van Brakel、Rebecca Wijers、Reno Debets和Dora Hämmerl共同撰写。本章并非一篇报告单一原创研究的论文，而是一篇详细的方法学指南或实验方案（Protocol）。它提供了对T细胞受体（T-cell receptor, TCR）进行基因工程改造、用于过继性细胞疗法的完整实验流程。因此，它属于类型c。以下是对该文档骨架的梳理和主要内容的提取。

一、 核心目标与主题

本章旨在提供一套完整的、步骤化的、可操作的实验室操作指南（Protocol），用于从临床前的研究中，鉴定、工程化改造并验证具有潜在治疗价值的T细胞受体（TCR）。其最终目标是建立一个标准化平台，以筛选出适合进入后续临床前研究和临床研究的候选TCR。内容聚焦于实验室操作细节，而非报告特定的实验结果。

二、 整体工作流程概览（方法论骨架）

文档将整个流程概括为三个核心步骤，并对应三个主要章节（Materials and Methods）： 1. 从抗原特异性T细胞中鉴定TCR序列：从识别特定肿瘤抗原的T细胞中，分离并确定其TCRα链和β链的基因序列。 2. 将TCR基因导入T细胞：将鉴定出的TCRα链和β链基因构建到表达载体中，通过逆转录病毒转导技术，将其导入来自健康供体的外周血单核细胞（PBMCs）来源的T细胞中，从而制造出TCR基因工程改造的T细胞。 3. 体外验证TCR的功能：对工程化T细胞进行一系列体外测试，以评估所表达TCR的表面表达水平、功能敏感性（对靶抗原的识别能力）和特异性（识别精确度），以及识别天然加工和呈递抗原的肿瘤细胞的能力。

三、 详细步骤与主要内容

第一步：TCR序列的鉴定 1. 研究对象的来源：肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）或健康供体/患者的外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）中分离出的抗原特异性T细胞。 2. 关键操作与技术： * 分离细胞：使用带有肽-主要组织相容性复合物（peptide-MHC, pMHC）的荧光标记多聚体，通过流式细胞分选（Fluorescent-Activated Cell Sorting, FACS）技术，分选出识别特定抗原的T细胞。 * 获取RNA：从分选出的T细胞中提取总RNA。 * 扩增与测序TCR序列：使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒（SMARTer RACE cDNA Amplification Kit），通过巢式PCR（nested PCR）技术，特异性扩增TCRα链和β链的cDNA。将PCR产物克隆到载体中，送至测序公司进行桑格测序（Sanger sequencing）。 * 序列注释与分析：将获得的基因序列上传至国际免疫遗传学数据库（IMGT database）和其工具HighV-QUEST，以注释TCR的V（可变区）、D（多样性区）、J（连接区）基因。使用EXPASy等在线工具确定正确的开放阅读框。最终，将注释好的α链和β链序列，通过T2A连接子（T2A linker）在DNA水平连接起来，设计成一个完整的TCR表达盒（α链和β链在同一转录本中，经翻译后自剪切为两条链），两侧加上限制性酶切位点和Kozak序列，为后续基因克隆做准备。

第二步：TCR基因转入T细胞（基因转移） 1. 研究对象/材料： * 靶细胞：来自健康供体的PBMCs（经CD3抗体OKT-3激活）。 * 病毒包装细胞：293T细胞和Phoenix-Ampho细胞系，用于生产携带TCR基因的逆转录病毒颗粒。 * 基因载体：包含完整TCRαβ序列（由T2A连接）的表达质粒（如pMP71），以及辅助包装质粒pHiT60和pCOLT-galv。 2. 关键操作与技术： * 病毒颗粒生产：使用磷酸钙转染法，将TCR表达质粒和辅助包装质粒共转染到293T和Phoenix-Ampho混合培养的包装细胞中。转染后更换培养基，收集含有病毒颗粒的上清液，并通过0.45 μm滤器过滤。 * PBMCs激活：分离PBMCs，并使用抗CD3单克隆抗体（OKT-3）进行激活，使其进入增殖状态，更容易被病毒感染。 * T细胞转导：使用Retronectin（一种重组纤维连接蛋白片段）预包被培养板，以增强病毒颗粒与T细胞的结合和感染效率。将激活的PBMCs与病毒上清液共孵育，通过离心感染（spinoculation）方式促进基因转导。该过程通常重复一次以提高转导效率。转导后的细胞在含有白细胞介素-2（Interleukin-2, IL-2）的培养基中扩增培养。

第三步：TCR的体外验证 这是评估候选TCR能否进入后续研究的关键环节，包含四个具体实验： 1. TCR转基因的表面表达检测： * 方法：使用与特定pMHC结合的PE标记多聚体（pMHC-PE Dextramer），通过流式细胞术检测转导后的T细胞表面是否成功表达外源的、具有正确抗原结合能力的TCR。同时用抗CD3、抗CD8抗体标记细胞。 * 判定标准：通常认为，当至少5%的CD3阳性T细胞能结合pMHC多聚体时，表明TCR成功表面表达。可作为后续功能实验的细胞筛选依据。 2. TCR转基因的敏感性（功能亲和力）检测： * 方法：将TCR工程化T细胞与抗原呈递细胞（如T2或BSM细胞系）共培养。这些抗原呈递细胞预先加载了不同浓度梯度的、与TCR对应的特定抗原肽（cognate epitope）。共培养16-24小时后，收集上清液。 * 检测指标：使用酶联免疫吸附测定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）测量上清液中干扰素-γ（Interferon-gamma, IFNγ）的分泌量。 * 意义：通过测定IFNγ分泌量随抗原肽浓度变化的曲线，可以计算出半最大有效浓度（EC50），从而评估该TCR的功能性亲和力（functional avidity）。EC50值越低，表明TCR对低剂量抗原的敏感性越高，潜在的治疗效果可能越好。 3. TCR转基因的特异性检测： * 方法：进行丙氨酸扫描（alanine scan）实验。将抗原肽序列中的每一个氨基酸逐一替换为丙氨酸，生成一系列突变肽。将TCR工程化T细胞与加载了这些突变肽（通常为单一浓度）的抗原呈递细胞共培养。 * 检测指标：同样通过ELISA测量IFNγ的分泌水平。 * 意义：比较T细胞对原始肽和各个突变肽的反应。如果某个位置的氨基酸被替换后，IFNγ分泌量显著下降（通常定义为至少降低两倍），则该氨基酸被认为是TCR识别的关键残基。所有关键残基构成了该TCR的“识别基序”（recognition motif）。识别基序越严格（关键残基越多），表明TCR的特异性越强，与非靶标（如自身正常组织）发生交叉反应的风险就越低。这是评估治疗安全性（避免脱靶毒性）的重要步骤。 4. 靶细胞识别检测： * 方法：将TCR工程化T细胞与表达目标肿瘤抗原和相应HLA分子的肿瘤细胞系（靶细胞）直接共培养。通常，靶细胞会预先用低剂量IFNγ处理，以增强其MHC分子的表达。 * 检测指标：共培养后，通过ELISA测量IFNγ的分泌水平。 * 意义：此实验检验TCR能否识别由肿瘤细胞自身抗原加工和呈递途径产生的天然抗原肽，而不仅仅是人工加载的外源性肽。这是TCR能否在体内有效识别并攻击肿瘤细胞的关键验证。

四、 文档的价值与特点

1. 综合性方法指南：本文档不是片段化的技术说明，而是提供了一个从“序列发现”到“功能验证”的端到端（end-to-end）整合性实验方案，具有很强的系统性和可操作性，对从事TCR-T疗法开发的研究人员具有直接的指导意义。
2. 强调临床前验证的完整性：文档特别突出了体外验证环节的重要性，尤其是敏感性和特异性检测，并将其流程化、标准化。这反映了在将TCR推向临床应用前，进行严格的安全性（特异性）和有效性（敏感性、靶细胞识别）评估的共识和最佳实践。
3. 细节详尽，包含实用注释：文档不仅列出了材料和步骤，还包含了大量的“Notes”（注释），提供了关键试剂的选择理由（如使用两种包装细胞系以提高病毒产量）、实验条件的优化建议（如RNA质量不佳时的处理）、结果判读的标准（如表面表达的cut-off值）以及潜在问题的解决方案，极具实用价值。
4. 反映技术现状与挑战：文中提及了该领域除所述方法外的其他可选技术（如单细胞RNA测序鉴定TCR、CRISPR-Cas9基因编辑结合TCR转导），并引用了相关文献，为读者提供了扩展视野的入口。同时，也指出了当前方法中的挑战，如转导效率的供体间差异、低表达TCR的评估等。
5. 作为标准化平台的基础：作者旨在通过这套详细的Protocol，为不同实验室建立一个可重复、可比较的TCR评估平台，从而促进高质量、低风险的候选TCR的筛选和鉴定，加速TCR-T疗法的临床转化进程。

本章是一份结构清晰、内容详实、高度专业的实验方法学文档。它系统地阐述了为过继性T细胞疗法开发TCR基因工程改造T细胞的完整临床前研究路径，涵盖了从分子克隆到细胞功能验证的全部关键技术环节，是该领域研究人员的重要参考资源。