本文献是一篇发表于2023年6月20日《Virus Research》期刊第334卷、编号为199149的原创性研究论文。由Rongrong Liu, Yunhua Lv, Wenjie Sun等人作为共同第一作者，Weijin Huang, Jiayi Shu, Xingan Wu作为共同通讯作者完成。研究团队来自第四军医大学微生物学教研室、复旦大学附属中山医院临床生物治疗中心、中国科学院上海巴斯德研究所、天津大学生命科学学院、中国食品药品检定研究院（NIFDC）艾滋病和性传播病毒疫苗室及WHO生物制品标准化和评价合作中心等多个国内知名研究机构。

该研究主要科学领域为疫苗学与病毒免疫学，聚焦于肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, HFRS）的新型疫苗研发。研究背景在于，HFRS作为一种由汉坦病毒（Hantavirus）感染引起的自然疫源性疾病，在亚洲和欧洲多个国家流行，每年全球约有2万病例。在中国和韩国，主要流行的病原体为汉滩病毒（Hantaan virus, HTNV）和首尔病毒（Seoul virus, SEOV）。目前仅有针对HTNV或SEOV的灭活全病毒疫苗，但其存在效力不足、安全性欠佳、诱导中和抗体滴度低、细胞免疫应答不充分以及生产过程中涉及活病毒操作带来的安全风险等问题。因此，研发更安全、更高效的新型疫苗是应对HFRS疫情、保障国家生物安全和人民健康的迫切需求。

该研究的核心目标是：利用生物信息学方法，基于HTNV和SEOV包膜糖蛋白（Envelope Glycoprotein, GP）的保守区域，设计一种通用的HFRS亚单位蛋白疫苗。该疫苗旨在克服传统灭活疫苗的缺点，通过诱导更强、更持久的体液免疫和细胞免疫应答，并提供对HTNV和SEOV的交叉保护。

研究详细流程如下：

第一步：疫苗设计与蛋白表达。 研究首先从NCBI数据库下载了166条HTNV和98条SEOV的包膜糖蛋白基因序列。针对每种血清型，分别计算出其包膜糖蛋白的共有序列（consensus sequence），即在每个氨基酸位点上，选择出现频率超过50%的残基作为候选序列。这一策略旨在涵盖广泛的病毒株多样性，设计出具有“通用”潜力的抗原。然后，他们基于共有序列，分别获取了HTNV和SEOV的Gn头部区域（1062 bp）和Gc胞外区域（1347 bp）的基因片段。为了提高蛋白表达量、溶解度和免疫原性，研究者根据黑腹果蝇（Drosophila）S2细胞的密码子偏好性对基因进行了优化，并去除了跨膜区的滞留信号。优化后的基因被克隆至S2细胞表达载体pMT/Bip/V5-His-A中，构建了六个重组质粒（分别对应HTNV-Gn、HTNV-Gc、SEOV-Gn、SEOV-Gc）。这些质粒转染S2细胞后，通过Blasticidin筛选获得稳定表达细胞株。利用氯化镉（CdCl2）诱导蛋白表达，收集细胞培养上清，通过镍亲和层析（Ni-NTA agarose）纯化得到带有His标签的重组蛋白。最终成功获得了四种高纯度的重组蛋白：HTNV-Gn、HTNV-Gc、SEOV-Gn和SEOV-Gc，并通过Western Blot确认了其分子量大小。

第二步：小鼠免疫与体液免疫应答评估。 研究者使用6-8周龄的SPF级BALB/c雌鼠作为动物模型。将小鼠分为6组，每组5只。实验组分别皮下注射纯化的HTNV-Gn、HTNV-Gc、SEOV-Gn、SEOV-Gc蛋白（10 μg/只），使用氢氧化铝（Alum）作为佐剂。对照组分别接种传统的HFRS灭活全病毒疫苗和PBS。共进行三次免疫。在第三次免疫后7-10天，采集小鼠血清。 1. 结合抗体检测： 采用酶联免疫吸附试验（ELISA），以包被的Gn和Gc蛋白检测血清中特异性IgG抗体的几何平均滴度（GMT）。结果显示，无论是HTNV还是SEOV，接种Gc蛋白的小鼠组产生的特异性结合抗体滴度最高（HTNV-Gc组高达1:27,216，SEOV-Gc组也很高），显著高于接种相应Gn蛋白的组别，更远高于灭活疫苗组。此外，HTNV免疫组和SEOV免疫组的血清对另一型病毒的蛋白也显示出交叉结合反应。 2. 中和抗体检测： 采用假病毒中和试验（使用VSVΔG-HTNVg和VSVΔG-SEOVg假病毒）和活病毒微量中和试验。结果一致表明，Gc蛋白（尤其是HTNV-Gc）诱导了最高水平的中和抗体（假病毒中和GMT为1:288），而Gn蛋白诱导的中和抗体滴度很低（HTNV-Gn组GMT仅为1:16），灭活疫苗诱导的中和抗体水平也显著低于Gc蛋白组。此外，HTNV-Gc和SEOV-Gc免疫血清能产生高滴度的交叉中和抗体。 3. 抗体亚型分析： 通过ELISA检测血清中IgG1、IgG2a、IgG2b、IgA和IgM的滴度。结果显示，所有免疫组中，IgG1的滴度均为最高，远高于其他亚型。计算IgG1/IgG2a和IgG1/IgG2b的比值，发现HFRS亚单位疫苗主要诱导Th2型偏向的体液免疫应答。

第三步：细胞免疫应答评估。 在第三次免疫后，分离小鼠脾细胞，通过酶联免疫斑点试验（ELISpot）检测抗原特异性T细胞分泌细胞因子的能力。 1. Th1/Th2反应： 用重组蛋白刺激脾细胞后，检测IFN-γ（Th1型标志）和IL-4（Th2型标志）的分泌。结果显示，与PBS对照组相比，所有疫苗免疫组的小鼠脾细胞均能分泌IFN-γ和IL-4。值得注意的是，IL-4的分泌水平普遍高于IFN-γ，这与抗体亚型分析中观察到的Th2偏向结果一致，表明该亚单位疫苗能有效诱导Th2型细胞免疫应答。

第四步：体内保护效力评估——乳鼠被动保护实验。 为了评估疫苗诱导的抗体的体内保护能力，研究者采用了经典的乳鼠攻毒模型。将各免疫组的血清与致死剂量的HTNV活病毒混合孵育后，腹腔注射给0-3日龄的BALB/c乳鼠（每组10只），连续观察16天，记录体重变化和存活率。 结果显示，接受HTNV-Gc免疫血清的乳鼠体重稳步增长，存活率达到100%。接受SEOV-Gc免疫血清的乳鼠提供了部分交叉保护，存活率为60%，但部分乳鼠后期出现体重下降。而接受HTNV-Gn、SEOV-Gn、灭活疫苗或PBS免疫血清的乳鼠，均在攻毒后第9天左右开始体重下降并迅速死亡，在16天内全部死亡。这一结果直接证明了HTNV-Gc蛋白诱导的抗体能够在体内提供完全的保护，抵御HTNV致死性攻击，其效力显著优于传统灭活疫苗。

第五步：生发中心（Germinal Center, GC）反应分析。 为了探究疫苗诱导高效体液免疫的机制，研究者在第二次和第三次免疫后第7天，取小鼠的引流淋巴结（腹股沟淋巴结）和脾脏，通过流式细胞术（Flow Cytometry）和免疫荧光染色分析生发中心反应。 1. 流式细胞术： 检测生发中心B细胞（GC B cell，表型为CD19+ CD38- CD95+）和滤泡辅助性T细胞（Tfh cell，表型为CD3+ CD4+ PD-1+ CXCR5+）。结果显示，在引流淋巴结中，所有蛋白免疫组和灭活疫苗组均能刺激产生大量的GC B细胞和Tfh细胞，且第三次免疫后细胞比例高于第二次。但在脾脏中，这些细胞的数量远少于淋巴结，表明免疫反应主要发生在引流淋巴结。 2. 免疫荧光染色： 对淋巴结组织切片进行多色免疫荧光染色，标记IgD（初始B细胞）、GL7（生发中心B细胞）、CD21（滤泡树突状细胞）、CD3（T细胞）。结果显示，接种了HFRS亚单位疫苗或灭活疫苗的小鼠淋巴结中，能够清晰地看到GL7+细胞形成的生发中心结构，这些结构与CD21hi的滤泡树突状网络紧密共定位，并与CD3+ T细胞区分开。而PBS对照组小鼠则未观察到明显的生发中心结构。这直观地证明了该疫苗能够有效诱导生发中心形成，这是产生高质量、高亲和力抗体和长效记忆B细胞的关键场所。

第六步：后续验证实验——成年鼠免疫攻毒后的病毒载量检测。 由于汉坦病毒感染成年BALB/c小鼠通常不引起明显病症，研究者在后续实验中，先对成年BALB/c小鼠进行免疫，然后用HTNV攻击，并在攻击后第1至7天检测血液中的病毒核酸载量（qRT-PCR）。结果补充显示，HTNV-Gc或SEOV-Gc免疫组小鼠的病毒载量低且保持稳定，与疫苗组和PBS组（病毒载量随时间升高）相比有显著差异，进一步证实了Gc蛋白免疫能有效保护小鼠抵御HTNV感染。

主要研究结论： 本研究成功设计并构建了一种基于HTNV和SEOV包膜糖蛋白共有序列的通用型HFRS亚单位蛋白疫苗。利用果蝇S2表达系统高效表达了具有正确折叠和糖基化修饰的Gn和Gc抗原。系统的临床前评估表明： 1. 免疫原性优异： 该疫苗，尤其是Gc蛋白成分，能在小鼠体内诱导出滴度显著高于传统灭活疫苗的高水平特异性结合抗体和中和抗体，并具有良好的HTNV与SEOV交叉反应性。 2. 免疫应答均衡： 疫苗能同时激发有效的体液免疫（Th2偏向，以高滴度IgG1抗体为特征）和细胞免疫（分泌IL-4和IFN-γ的T细胞应答）。 3. 保护效力确凿： HTNV-Gc免疫血清能100%保护乳鼠免受致死剂量HTNV的攻击，SEOV-Gc也显示出部分交叉保护作用，而灭活疫苗则无保护效果。成年鼠攻毒实验也证实了Gc蛋白免疫能有效控制病毒复制。 4. 作用机制明确： 疫苗能有效诱导引流淋巴结中生发中心（GC）的形成，促进GC B细胞和Tfh细胞的增殖与分化，这为产生高效、持久的中和抗体提供了细胞学基础。

研究的科学与应用价值： 1. 科学价值： 为设计针对高变异病毒的“通用”疫苗提供了新的思路和方法论范例，即通过计算共有序列来最大化抗原的覆盖广度。深入揭示了HFRS亚单位疫苗（特别是Gc蛋白）诱导保护性免疫的详细机制，包括抗体应答特征、细胞免疫类型以及生发中心反应的关键作用。 2. 应用价值： 研发出一种潜在的安全（无感染性病毒成分）、高效（保护力优于现有灭活疫苗）、稳定、易于规模化生产的HFRS新型候选疫苗。Gc蛋白被确定为关键的保护性抗原靶点，为后续疫苗的优化（如选择最佳抗原、搭配新型佐剂）指明了方向。该研究为解决HFRS这一重要公共卫生问题提供了有前景的疫苗候选方案。

研究的亮点： 1. 创新性的疫苗设计策略： 首次将生物信息学驱动的共有序列设计与果蝇S2表达系统相结合，用于开发抗汉坦病毒的通用亚单位疫苗。 2. 系统全面的临床前评价： 从抗原设计、表达纯化，到体液免疫、细胞免疫、体内保护效力（乳鼠和成年鼠模型）、以及免疫机制（生发中心反应）进行了多维度、深层次的系统评估，数据完整，说服力强。 3. 明确的抗原比较结果： 研究清晰比较了Gn和Gc蛋白的免疫效果，强有力地证明Gc是诱导中和抗体和体内保护的关键抗原，为未来疫苗开发提供了关键靶点。 4. 机制探究深入： 不仅评估了最终的免疫保护效果，还通过流式细胞术和免疫荧光等手段深入探究了疫苗诱导生发中心反应的微观机制，将疫苗性能与免疫学过程紧密联系起来。

其他有价值的内容： 研究者在讨论部分也客观指出了当前使用的铝佐剂（Alum）主要诱导Th2应答的局限性，并展望了未来可能采用的新型佐剂（如锰佐剂、热休克蛋白HSP70等）来进一步提升免疫效果，尤其是增强Th1或细胞毒性T淋巴细胞（CTL）应答，这显示了研究者对疫苗优化路径的清晰思考。此外，论文也提及了该亚单位疫苗策略相较于核酸疫苗、病毒载体疫苗等其他基因工程疫苗在安全性和生产简便性上的潜在优势。