本次研究的通讯作者是来自华中科技大学同济医学院附属协和医院胃肠外科的吴传庆教授（Chuanqing Wu）和陶凯雄教授（Kaixiong Tao）。主要作者还包括马贤雄、陈恒宇和李雷，其中这三位作者为共同第一作者。此项研究发表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》（J Exp Clin Cancer Res）期刊，于2021年发表，文章编号为(2021) 40:330。
本研究属于肿瘤分子生物学领域，聚焦于胃癌的发生发展与调控机制，特别是环状RNA（circular RNA， circRNA）在其中扮演的角色。胃癌是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的主要原因之一。尽管手术治疗是根治性手段，但对于晚期和转移性胃癌，生存率仍然很低。因此，深入探索胃癌发展和转移的分子机制，以发现新的治疗靶点，是当前研究的迫切需求。
环状RNA是一类通过前体mRNA外显子反向剪接形成的共价闭合单链环状非编码RNA。越来越多的证据表明，circRNA在基因表达调控中扮演关键角色，并且参与了多种癌症的发生和发展。然而，一个名为circGSK3β（hsa_circ_0003763）的circRNA，虽然在肝细胞癌中被发现能促进细胞增殖、迁移和侵袭，但其在胃癌中的具体功能和作用机制尚不清楚。基于此背景，本研究旨在探究circGSK3β在胃癌进展中的作用及其潜在的分子机制。
本研究是一项系统性的基础研究，整合了生物信息学分析、体外细胞实验和体内动物模型验证，流程清晰、逻辑严密，主要包含以下步骤：
1. circRNA的筛选与鉴定： * 研究对象与样本量：研究者首先从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus， GEO）和ArrayExpress数据库中，系统检索并获取了与胃癌相关的circRNA表达谱数据集。经过筛选，最终纳入了6个符合标准的微阵列芯片数据集（GSE78092、GSE83521、GSE89143、GSE93541、GSE100170和GSE141977），共包含23个胃癌组织和23个正常胃组织样本。 * 数据处理与分析：研究者使用“limma”R包对原始数据进行预处理，并使用“metade”R包进行整合分析，以鉴定在胃癌与正常组织之间差异表达的circRNA（differentially expressed circRNAs， DECs）。该分析共鉴定出14个DECs。 * 实验验证：为了验证这些DECs，研究者从人胃癌细胞系中提取cDNA，使用针对circRNA设计的背向引物进行PCR扩增，并对PCR产物进行Sanger测序。结果确定了三个circRNA与NCBI数据库序列信息一致。随后，通过实时定量聚合酶链反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction， RT-qPCR）在5种胃癌细胞系（SGC7901、BGC823、BGC803、AGS、MKN45）、1种正常胃黏膜细胞系（GES-1）以及56对临床胃癌与癌旁组织样本中检测了这三个circRNA的表达水平。结果表明，只有circGSK3β在胃癌组织和细胞系中持续显著下调。因此，研究选定circGSK3β进行后续深入研究。 * circRNA特性验证：为了确认其环状结构，研究者使用了转录抑制剂放线菌素D处理细胞，发现circGSK3β的半衰期超过24小时，远长于其线性转录本（约8小时），显示出circRNA固有的高稳定性。同时，circGSK3β对RNase R核酸外切酶消化表现出抵抗，进一步证实了其环状结构。通过RNA荧光原位杂交（RNA-fluorescence in situ hybridization， FISH）技术，发现circGSK3β主要定位于细胞核内。
2. circGSK3β的生物学功能探究： * 体外功能实验：研究者在胃癌细胞系MKN45和AGS中，通过构建过表达circGSK3β的质粒和设计靶向circGSK3β的短发夹RNA（short hairpin RNA， shRNA）来分别上调和敲低circGSK3β的表达。随后，通过一系列细胞功能实验评估其影响： * MTT实验和克隆形成实验：检测细胞增殖能力。 * Transwell小室实验：检测细胞迁移和侵袭能力。 * 流式细胞术：分析细胞周期分布和细胞凋亡情况。 * 体内功能实验：为了在活体水平验证，研究者构建了裸鼠皮下移植瘤模型。将稳定过表达或敲低circGSK3β的MKN45细胞皮下注射到BALB/c裸鼠体内，观察肿瘤生长情况。一个月后，处死小鼠，测量肿瘤体积和重量。同时，对肿瘤组织进行免疫组织化学（Immunohistochemistry， IHC）染色，检测细胞增殖标志物Ki-67和血管内皮标志物CD31的表达。
3. circGSK3β作用机制的探索： 这是本研究的核心和亮点环节，研究者采用了一系列前沿技术来阐明circGSK3β如何发挥其抑癌功能。 * 寻找相互作用蛋白： * 研究者使用生物素标记的RNA pull-down实验，将体外转录的circGSK3β正义链和反义链进行生物素标记，然后与胃癌细胞裂解液孵育，下拉与之结合的蛋白质。 * 下拉产物通过质谱分析（Mass Spectrometry， MS）进行鉴定。同时，将质谱鉴定到的蛋白与已知的RNA结合蛋白及转录因子数据库进行交叉比对，筛选出9个潜在的circGSK3β相互作用蛋白。 * 为了进一步验证，研究者进行了RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation， RIP）实验。使用针对候选蛋白（如EZH2、EED、SUZ12等）的抗体去沉淀细胞内的核糖核蛋白复合物，然后通过RT-qPCR检测其中circGSK3β的富集情况。结果证实，circGSK3β能够与EZH2及其所在的多梳抑制复合物2（Polycomb Repressive Complex 2， PRC2）的其他核心成员EED和SUZ12特异性结合，而与另外几个候选蛋白无相互作用。 * 通过双重RNA-FISH与免疫荧光共定位实验，在显微镜下直观地观察到circGSK3β与EZH2蛋白在细胞核内存在明显的共定位，支持了它们之间存在直接相互作用的可能性。 * 为了精确定位相互作用区域，研究者构建了EZH2蛋白的不同截短体，通过体外结合实验，最终确定EZH2蛋白的D2结构域（第200-350个氨基酸）是结合circGSK3β的关键区域。 * 探索下游靶基因及调控通路： * 研究者首先排除了circGSK3β对其母体基因GSK3β的顺式调控（cis-regulation）作用。 * 为了寻找其反式调控（trans-regulation）的靶基因，研究者对过表达circGSK3β的MKN45细胞进行了RNA测序（RNA sequencing， RNA-seq），鉴定出1004个差异表达基因（Differentially Expressed Genes， DEGs）。 * 将这些DEGs与从BioGRID数据库和TFTargets R包中获取的EZH2靶基因进行交叉分析，筛选出10个潜在的下游靶基因。 * 通过RT-qPCR验证，发现只有RORα（Retinoic acid receptor-related orphan receptor α）的表达变化与circGSK3β的表达水平一致（circGSK3β过表达则RORα上调，敲低则下调）。而其他9个基因未受影响。 * 进一步的研究表明，当同时过表达circGSK3β和EZH2时，由circGSK3β引起的RORα表达上调被逆转，提示EZH2负向调控RORα。 * 阐明具体的表观遗传调控机制： * EZH2是PRC2的催化亚基，其经典功能是通过催化组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化（H3K27me3），从而抑制靶基因的转录。 * 研究者通过染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation， ChIP）实验发现，在过表达circGSK3β的细胞中，EZH2蛋白及其催化的H3K27me3标记在RORα基因启动子区域的结合显著减少。 * 同时，蛋白质印迹法（Western blot）结果显示，circGSK3β过表达能上调RORα蛋白水平，并下调H3K27me3、β-catenin及其下游靶基因Cyclin D1（CCND1）的蛋白水平，而EZH2过表达则产生相反效果。 * 机制模型由此清晰：circGSK3β通过其D2结构域与EZH2直接结合，这种结合“占据”了EZH2，阻止了EZH2及其催化的H3K27me3修饰结合到RORα基因的启动子区，从而解除了EZH2对RORα的表观遗传沉默，使RORα表达得以恢复。而RORα作为一个已知的肿瘤抑制因子，能够通过促进β-catenin的磷酸化降解来抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路，最终遏制肿瘤进展。
4. 功能回补验证实验： 为了最终确认circGSK3β→EZH2→RORα这条信号轴的功能逻辑，研究者设计了一系列精巧的回补（rescue）实验。 * 在敲低circGSK3β的MKN45细胞中，同时敲低EZH2（或使用EZH2抑制剂GSK126），可以逆转因circGSK3β缺失导致的细胞增殖、迁移侵袭增强以及凋亡减少等表型。而如果在敲低circGSK3β和EZH2的基础上，再敲低RORα，则上述促癌表型又会部分恢复。 * 在过表达circGSK3β的AGS细胞中，同时过表达EZH2，可以逆转circGSK3β带来的抑癌效果。而若在此基础上再额外过表达RORα，则又能部分恢复抑癌效应。 这些严谨的回补实验强有力地证明了circGSK3β是通过抑制EZH2、进而上调RORα来发挥其肿瘤抑制功能的。
5. 临床相关性分析： 为了将基础研究发现与临床实际联系起来，研究者分析了56例胃癌患者组织中circGSK3β、EZH2和RORα的表达水平与临床病理参数及预后的关系。 * 结果显示，circGSK3β的低表达和EZH2的高表达与更大的肿瘤体积、淋巴结转移、更高的TNM分期显著相关。EZH2高表达还与血管侵犯和不良预后相关。 * RORα的低表达则与更高的TNM分期相关。 * 相关性分析进一步显示，在胃癌组织中，circGSK3β或RORα的表达水平与EZH2的表达呈显著负相关，而circGSK3β与RORα的表达呈显著正相关。 这些临床数据为circGSK3β/EZH2/RORα轴在胃癌发生发展中的重要作用提供了来自患者群体的证据支持。
本研究得出的核心结论是：circGSK3β在胃癌中充当一种肿瘤抑制因子。它通过直接结合EZH2蛋白，阻止EZH2及其催化的H3K27me3修饰结合到RORα基因的启动子区域，从而解除EZH2对RORα的转录抑制，上调RORα的表达。恢复表达的RORα通过抑制Wnt/β-catenin信号通路，最终遏制胃癌细胞的恶性进展。
科学价值： 1. 揭示了circRNA作用的新机制：本研究阐明了circGSK3β并非通过传统的“分子海绵”吸附miRNA的方式发挥作用，而是作为一种“蛋白诱饵”或“干扰因子”，直接在蛋白水平与表观遗传修饰酶EZH2相互作用，干扰其功能，从而激活下游抑癌基因。这为circRNA的功能多样性研究提供了新范式。 2. 阐明了胃癌中一条新的调控通路：首次系统性地描绘了“circGSK3β—EZH2—RORα—Wnt/β-catenin”这条全新的信号轴在胃癌发生发展中的精细调控网络，深化了对胃癌表观遗传调控机制的理解。 3. 提供了潜在的治疗靶点：circGSK3β、EZH2和RORα均被证明是影响胃癌进展的关键分子。circGSK3β本身作为一种RNA，EZH2作为可药物靶向的表观遗传酶，为开发针对该通路的新型胃癌治疗策略（如基于circGSK3β的基因治疗、EZH2抑制剂与现有疗法的联合应用等）提供了重要的理论依据和候选靶点。
应用价值： 1. 预后标志物潜力：circGSK3β的低表达、EZH2的高表达与胃癌的不良临床病理特征和预后相关，提示它们可能作为评估胃癌患者预后的潜在生物标志物。 2. 治疗新思路：基于该研究，增强circGSK3β的表达或活性（例如通过RNA递送技术）、或使用EZH2特异性抑制剂，可能成为未来胃癌治疗的新方向。文章末尾也明确指出，circGSK3b具有作为胃癌治疗靶点的潜力。