本文献的研究论文《Anti–PD-L1 Treatment Results in Functional Remodeling of the Macrophage Compartment》于2019年4月1日发表于《Cancer Research》期刊。该研究由来自基因泰克（Genentech）公司转化肿瘤学部和生物信息与计算生物学部的Huizhong Xiong、Stephanie Mittman、Ryan Rodriguez、Marina Moskalenko、Patricia Pacheco-Sanchez、Yagai Yang、Dorothee Nickles和Rafael Cubas共同完成。

这项研究隶属于肿瘤免疫学领域，旨在探究免疫检查点抑制剂治疗，特别是抗程序性死亡配体-1（Anti-Programmed Death-Ligand 1, anti-PD-L1）疗法，对肿瘤微环境中至关重要的固有免疫细胞——肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）的影响。背景知识在于，虽然以anti-PD-1/PD-L1为代表的检查点抑制剂通过“解放”CD8+ T细胞，在部分癌症患者中取得了显著疗效，但它们对肿瘤微环境内大量存在的、具有强大免疫调节功能的髓系细胞，尤其是巨噬细胞的影响却知之甚少。巨噬细胞具有高度的可塑性，其功能状态大致可分为促炎的M1型（经典活化）和抑制免疫的M2型（替代性活化）。在肿瘤中，TAMs通常呈现为免疫抑制性的M2样表型，促进肿瘤生长、侵袭并抑制T细胞功能。因此，本研究的核心目标是明确anti-PD-L1治疗是否能影响TAMs的表型与功能，并阐明其潜在机制。研究最终发现，在响应的肿瘤模型中，anti-PD-L1治疗能通过增加干扰素γ（Interferon-gamma, IFNγ）信号，将巨噬细胞区室重塑为更偏向促炎的M1样表型，从而增强抗肿瘤T细胞反应，并提出了针对巨噬细胞的联合治疗策略。

研究的详细工作流程包含以下主要步骤和相应的实验方法： 首先，研究者确立了研究模型与基线分析。他们选择了三种具有不同anti-PD-L1响应特性的小鼠肿瘤模型：部分响应的MC38结肠腺癌模型、响应的EMT6乳腺肿瘤模型以及无响应的JC乳腺肿瘤模型。研究首先聚焦于MC38模型，因为该模型具有显著的巨噬细胞浸润。通过流式细胞术分析未治疗肿瘤，他们确认了TAMs（定义为CD45+ F4/80+ CD11b+细胞）是肿瘤内主要的免疫细胞群。进一步通过表面标记物MHCII和CD206将TAMs分为M1样（MHCII+CD206-）、M2样（MHCII-CD206+）和中间表型（MHCII+CD206+）亚群。关键功能标记物如精氨酸酶-1（Arginase-1, Arg1）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、MHCII、CD40的表达水平也被检测。研究发现，随着肿瘤负荷增加，TAMs表型向更抑制性的M2样状态偏移，且Arg1表达与肿瘤大小正相关，而iNOS和MHCII表达与之负相关，这为后续评估治疗影响提供了基线。 其次，研究者系统评估了anti-PD-L1治疗对TAMs表型和T细胞的影响。在MC38荷瘤小鼠肿瘤长至约180 mm³时，将其随机分组，接受anti-PD-L1抗体（克隆6E11）或同型对照抗体治疗。治疗后第7天（此时治疗组与对照组肿瘤大小仍可比），收集肿瘤进行流式分析。结果显示，anti-PD-L1治疗显著延迟了MC38肿瘤生长，并诱导了10%的完全缓解。更重要的是，治疗显著降低了TAMs上免疫抑制标志物Arg1的表达，同时提高了促炎标志物iNOS、MHCII和共刺激分子CD40的表达。此外，肿瘤内CD8+ T细胞的数量、颗粒酶B（Granzyme B, GzmB）的产生以及CD8+/调节性T细胞（Treg）的比率均显著增加。相关性分析进一步表明，TAMs上Arg1水平与CD8+ T细胞的丰度和功能负相关，而iNOS水平与之正相关，这提示了TAMs表型改变与T细胞激活之间存在联系。 第三，为了探究这种表型重塑是来源于原有TAMs的重编程，还是新募集的单核细胞分化的结果，研究进行了过继性单核细胞转移实验。他们将CD45.1小鼠的骨髓源性单核细胞过继转移到已接受anti-PD-L1或对照抗体治疗的MC38荷瘤（CD45.2）小鼠体内。两天后分析发现，在治疗组小鼠肿瘤中，新分化而来的供体源性TAMs展现出更高的M1样比例，以及更低的Arg1、更高的iNOS和CD40表达。新募集的供体单核细胞也表现出更强的促炎表型。这证明anti-PD-L1治疗创造了一个能“教育”新募集单核细胞/巨噬细胞向促炎表型分化的微环境。 第四，研究者通过高通量测序技术进行了全转录组分析，以更全面地理解anti-PD-L1诱导的巨噬细胞变化。他们从治疗组和对照组的MC38肿瘤中分选出了TAMs和单核细胞进行RNA测序。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）揭示，治疗后巨噬细胞的基因表达谱发生了深刻的、全基因组范围的重编程。显著上调的基因集包括抗原提呈相关分子（如MHC家族）、Fcγ受体（与吞噬和抗体依赖性细胞毒性相关）、IFNγ信号通路、促炎信号、趋化因子以及自噬通路。同时，多个与胶原蛋白合成和发育相关的基因集下调。单核细胞也显示出类似的转录组重塑趋势，表明PD-L1阻断对巨噬细胞及其前体细胞均有深远影响。 第五，机制探索集中于驱动这种重塑的关键因子。对肿瘤裂解液的细胞因子分析发现，anti-PD-L1治疗后肿瘤内IFNγ水平显著升高，其主要来源是肿瘤内的CD8+ T细胞。功能上，使用中和性抗体阻断IFNγ，完全取消了anti-PD-L1的抗肿瘤疗效，同时也阻断了治疗诱导的巨噬细胞向M1样表型极化以及iNOS、MHCII、CD40的上调和Arg1的下调。为了直接证明IFNγ信号对巨噬细胞表型的必要性，研究构建了混合骨髓嵌合体小鼠：将野生型（IFNγR+/+）和IFNγ受体缺陷型（IFNγR-/-）骨髓细胞混合移植给亚致死剂量照射的野生型受体小鼠，再接种MC38肿瘤并进行治疗。结果发现，无论是否接受anti-PD-L1治疗，源自IFNγR-/-骨髓的TAMs都持续表现为更高的M2样比例、更高的Arg1和更低的iNOS、MHCII、CD40表达。这直接证明了TAMs自身的IFNγ信号是anti-PD-L1介导的巨噬细胞表型重塑所必需的。 第六，研究开发了体外功能验证体系。他们收集了来自治疗组和对照组MC38肿瘤的消化上清，用以极化体外培养的骨髓源性巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages, BMDMs）。结果显示，来自anti-PD-L1治疗肿瘤的上清能使BMDMs从M2样向中间表型偏移，并上调MHCII、CD40等分子。这种极化效应可被IFNγ中和抗体部分逆转。更重要的是，功能上，用治疗组肿瘤上清极化的BMDMs在负载OVA抗原后，能更有效地促进共培养的抗原特异性CD4+ T细胞（OT-II细胞）的增殖和活化（表现为更高的CFSE稀释度以及CD25、CD69、CD44/ICOS表达）。这证实了anti-PD-L1治疗后的肿瘤微环境不仅能改变巨噬细胞表型，还能增强其抗原提呈和激活T细胞的功能。 第七，研究将观察拓展到其他肿瘤模型，并探索了靶向巨噬细胞的联合治疗策略。在响应的EMT6模型中也观察到了与MC38类似的巨噬细胞重塑（向M1样偏移，Arg1下降，iNOS、MHCII、CD40上升），而在无响应的JC模型中则未观察到这些变化，且JC模型中治疗后IFNγ诱导不明显。鉴于巨噬细胞的高负荷和抑制性表型可能限制治疗效果，研究者评估了联合靶向巨噬细胞的策略。他们测试了抗CD40激动剂抗体（aCD40，可激活/重编程巨噬细胞）和抗集落刺激因子1受体抗体（aCSF1R，可消耗巨噬细胞和单核细胞）。在EMT6模型中，联合aCD40能进一步增强anti-PD-L1的疗效和巨噬细胞的M1样极化。然而，在巨噬细胞负荷更高、抑制性更强的MC38模型中，单独联合aCD40或aCSF1R对anti-PD-L1的增效有限。但引人注目的是，在MC38模型中，三联疗法（anti-PD-L1 + aCD40 + aCSF1R）显示出最强的协同抗肿瘤效果，实现了90%的完全缓解率，显著优于任何双药组合或单药治疗。这表明，在高巨噬细胞负荷的肿瘤免疫环境中，需要同时进行巨噬细胞的重编程和耗竭，才能最大化anti-PD-L1的治疗反应。

该研究取得的主要结果包括：1）揭示了anti-PD-L1治疗在响应肿瘤模型中能诱导TAMs和单核细胞发生显著的、向促炎/免疫刺激表型的表型与功能重塑；2）证明了这种重塑主要由治疗所增加的、由CD8+ T细胞产生的IFNγ驱动，并且依赖于巨噬细胞自身的IFNγ受体信号；3）明确了重塑后的巨噬细胞具有更强的抗原提呈能力，并能反过来促进T细胞的增殖与活化，形成正反馈环路；4）发现在不同肿瘤模型中，巨噬细胞重塑的程度与治疗响应性相关；5）创新性地提出并验证，在高巨噬细胞负荷的肿瘤中，联合使用巨噬细胞重编程（aCD40）和耗竭（aCSF1R）策略，能最大程度地增强anti-PD-L1的疗效。

研究的结论具有重要的科学价值和临床应用潜力。其科学意义在于，它突破了检查点抑制剂作用机制主要集中于T细胞的传统认知，首次系统阐明了anti-PD-L1治疗能通过T细胞-IFNγ轴，间接而有效地重塑肿瘤固有免疫核心组分——巨噬细胞区室，使其从“帮凶”转变为“盟友”，从而形成增强抗肿瘤免疫的正反馈环路。这为理解检查点抑制剂的全身性免疫调节效应提供了新维度。在应用层面，该研究为克服免疫治疗耐药、扩大获益人群提供了直接的策略指导。它提示，肿瘤的免疫微环境，特别是巨噬细胞的丰度与表型，是决定治疗响应的重要因素。对于巨噬细胞密集且呈抑制性表型的肿瘤（“冷肿瘤”或免疫抑制型肿瘤），单纯使用检查点抑制剂可能效果有限。此时，联合针对巨噬细胞的疗法，尤其是同时进行“去抑制”（重编程）和“减数量”（耗竭）的双重打击策略，有望重新编程肿瘤免疫微环境，降低免疫抑制阈值，从而显著提升对PD-1/PD-L1抑制剂的反应率和反应深度。

本研究的亮点突出：首先，在发现层面，首次详细揭示了anti-PD-L1治疗对肿瘤巨噬细胞区室的功能性重塑作用及其关键机制，填补了该领域的重要知识空白。其次，在研究方法的系统性上，结合了体内肿瘤模型、过继细胞转移、嵌合体模型、体外共培养、全转录组测序和多种流式分析技术，从现象、机制到功能进行了多维度、深层次的论证，逻辑链条完整严密。第三，在转化医学价值上，不仅解释了现象，更进一步通过巧妙的组合治疗实验，提出了具有高度临床指导意义的联合治疗策略，并明确了其适用情境（巨噬细胞高负荷的抑制性微环境），将基础研究发现直接指向了临床研发的新方向。这些发现深化了对肿瘤免疫治疗机制的理解，并为开发更有效的联合免疫疗法奠定了坚实的理论基础。