本研究由中国科学院武汉物理与数学研究所、磁共振与原子分子物理国家重点实验室的Y.F. Cui, G.Y. Bai, C.G. Li, C.H. Ye以及通讯作者M.L. Liu（刘买利）共同完成，其中C.G. Li的研究完成后通讯地址变更为美国国家高磁场实验室。合作单位还包括华中师范大学化学系。该研究成果以《Analysis of competitive binding of ligands to human serum albumin using NMR relaxation measurements》为题，发表于《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》期刊2004年第34卷（第247-254页），论文于2003年7月27日收到，2003年9月2日正式接受。
研究的学术背景主要属于药物分析与生物物理化学交叉领域，具体关注药物-蛋白质相互作用。人血清白蛋白（Human Serum Albumin， HSA）是血浆中主要的药物结合蛋白，能与大量药物分子结合。这种结合过程控制着游离（即有生物活性）药物的浓度，从而影响药物的药代动力学、储存、毒性、向组织的转运能力以及透过细胞膜的能力。因此，研究药物与HSA的相互作用具有重要的药理学意义。HSA拥有三个高亲和力结合位点（位点I、II、III）以及众多低亲和力结合位点。当两种分子结构相似的药物共同给药时，预计会发生竞争性结合，导致血液中游离药物的浓度比例与给药比例不同。布洛芬（Ibuprofen， IBP）和水杨酸（Salicylic Acid， SAL）是两种已知能与HSA结合的模型药物。IBP主要高亲和力结合于位点III，而SAL可结合于位点II和III。此前的研究表明，两者在HSA上均存在数十个低亲和力结合位点。由于共享高亲和力位点III且拥有大量低亲和力位点，IBP和SAL被认为是研究配体与HSA竞争性低亲和力结合的理想体系。本研究的目标是证明核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance， NMR）波谱学可以作为研究两种配体（IBP和SAL）与蛋白质（HSA）在低亲和力位点竞争性结合的一种替代方法，并利用NMR氢核（1H）自旋-晶格弛豫速率（R1）测量对竞争性结合进行定量分析。
详细的工作流程包含几个核心步骤：样品制备、NMR数据采集、数据处理与分析。
首先，在样品制备阶段，研究设计并制备了三组样品，所有样品均使用pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制，并添加10% D2O用于NMR仪锁场。第一组样品仅含有不同浓度的IBP和SAL，用于测量游离配体的1H弛豫速率（R1f）。第二组样品包含固定浓度的HSA（0.2 mM）和一种浓度可变的配体（IBP: 4.0–60 mM 或 SAL: 4.0–65 mM）。这组样品用于外推结合态配体的1H弛豫速率（R1b）。第三组样品用于研究IBP和SAL与HSA的竞争性结合，分为两个系列。第一个系列中，HSA和SAL的浓度固定为0.2 mM和8.0 mM，而IBP的浓度在4.0, 8.0, 12.0, 16.0, 20.0 mM之间变化。第二个系列中，HSA（0.2 mM）和IBP（8.0 mM）浓度固定，SAL的浓度在4.0, 8.0, 12.0, 16.0, 20.0, 24.0 mM之间变化。这种设计使得研究者可以系统地观察一种配体浓度变化对另一种配体结合状态的影响。所有实验在298 K温度下进行。
其次，在NMR数据采集阶段，实验使用Varian Inova-500谱仪，质子共振频率为500.12 MHz。采用标准的反转恢复法测量质子的纵向弛豫速率（R1），并在预扫描延迟和恢复延迟期间加入溶剂压制脉冲以消除水峰信号干扰。对于不含HSA的溶液，使用的16个恢复延迟时间在0.1至4秒之间随机选取；对于含有HSA的溶液，则使用0.1至20秒的恢复延迟，以适应更慢的弛豫过程。每次实验通常采集32次瞬态信号，谱宽6000 Hz，数据点16K。数据处理时，应用余弦窗函数（0 ∼ π/2）提高信噪比，并在傅里叶变换前进行两倍零填充。
第三，在数据处理与分析工作流程中，研究者使用峰面积来推导弛豫速率，拟合公式为A(t) = A0 − [A0 − A(0)] exp(−R1t)，其中A(t)、A(0)和A0分别是在恢复时间t、0和热平衡时的峰面积。对于快速交换的配体-蛋白质结合体系，观测到的1H弛豫速率（R1ob）是游离态（R1f）和结合态（R1b）弛豫速率的权重平均值：R1ob = ffR1f + fbR1b，其中ff和fb分别代表游离和结合配体的摩尔分数。由此，结合分数可以直接从弛豫速率数据推导：fb = (R1ob − R1f) / (R1b − R1f)。进一步，利用结合模型HSA · L ⇌ HSA + L，通过公式cl = ncp / fb − kd / (1 − fb)（其中cl和cp分别为配体和HSA的总浓度），可以计算出表观解离常数（kd）和结合位点数（n）。本研究使用Microcal Origin 5.0软件进行此类非线性拟合。
研究获得的主要结果如下：
在第一部分，确定了游离和结合态的弛豫速率基准。在无HSA的IBP和SAL混合溶液中，未观察到化学位移或线型的明显变化，NOESY谱也未见分子间NOE信号，表明在实验条件下两者动力学独立。由此测得的游离态弛豫速率（R1f）为：IBP的H4,7质子0.486±0.018 s−1，H5,6质子0.53±0.02 s−1，H3质子1.35±0.02 s−1，H10质子0.99±0.02 s−1；SAL的H6、H4、H3,5质子均为0.19±0.01 s−1。当体系中加入0.2 mM HSA后，IBP和SAL的NMR谱峰均出现显著的线宽增宽和化学位移向高场漂移（见表1数据）。例如，在IBP和SAL各8.0 mM、HSA 0.2 mM的溶液中，IBP的谱线宽于SAL。当IBP浓度从8.0 mM增至20.0 mM时，IBP和SAL的谱峰均变尖锐，化学位移向游离态值靠近，直观证明IBP浓度增加导致其自身游离分数增加，同时也取代了部分结合态的SAL，使其游离分数增加，即发生了竞争性结合。化学位移的变化对IBP浓度的依赖性大于对SAL浓度的依赖性，暗示IBP对HSA的结合亲和力高于SAL。
在第二部分，通过外推法获得了结合态弛豫速率（R1b）并推导了结合参数。以弛豫速率变化值Δ(R1ob - R1f) 对配体浓度作图（图2a, 2b），外推得到结合态的弛豫速率R1b：SAL的H6质子为1.90±0.14 s−1，H4质子为1.94±0.18 s−1，H3,5质子为2.02±0.14 s−1；IBP的H5,6质子为3.63±0.18 s−1，H4,7质子为3.56±0.23 s−1，H3质子为4.15±0.28 s−1，H10质子为4.21±0.25 s−1。IBP的CH3(3)质子（来自异丙酸链）的ΔR1较小，表明该部分远离结合中心，这与之前不同pH下的研究结论一致。利用这些R1f、R1b值和测得的R1ob，通过公式（3）计算了不同浓度下配体的结合分数fb（图2c, 2d）。尽管IBP不同质子的ΔR1有差异，但计算得到的结合分数相似。进一步通过公式（6）拟合，得到了IBP和SAL在HSA上的表观解离常数kd和结合位点数n：IBP的kd为1.39 ± 0.16 mM，n为33.2 ± 1.5；SAL的kd为4.27 ± 0.48 mM，n为35.0 ± 2.3。这些数值与文献报道吻合，验证了该方法在此浓度范围内的适用性和结合性质的一致性。
在第三部分，也是核心部分，定量分析了竞争性结合行为。在固定SAL (8.0 mM) 和 HSA (0.2 mM)、变化IBP浓度的实验中（图3a, 3c），随着IBP浓度从4.0 mM增加到20.0 mM，游离IBP的分数从0.35增至0.66，游离SAL的分数从0.59增至0.83。同时，结合态IBP的浓度（cb,ibp）有所增加，但增幅小于在仅有IBP和HSA的二元体系中的增幅（被SAL占据部分位点）；而结合态SAL的浓度（cb,sal）则从约1.6 mM下降到约0.7 mM，表明增加的IBP占据了结合位点，导致HSA·SAL复合物解离。在固定IBP (8.0 mM) 和 HSA (0.2 mM)、变化SAL浓度的反向实验中（图3b, 3d），也观察到类似现象：游离SAL分数增加，游离IBP分数略有增加；结合态SAL的浓度显著低于其在二元体系中的值，而结合态IBP的浓度仅从约4.6 mM轻微下降到约4.2 mM。这再次印证了IBP具有更高的结合亲和力。一个关键的发现是，在IBP-SAL-HSA三元体系中，两种配体结合浓度的总和（cb,ibp + cb,sal）高于它们在各自二元体系中的结合浓度（图3c中的三角符号高于方形和菱形符号）。这一结果明确指示，IBP和SAL在HSA上的结合位点并非完全重叠，它们除了共享一部分结合位点（在此发生竞争）外，还各自拥有一些特异性结合位点。
研究的结论是，利用核磁共振弛豫测量，成功观察并研究了布洛芬和水杨酸与人血清白蛋白之间的竞争性低亲和力结合。研究证明，基于快速可逆结合反应模型，可以从R1数据计算出结合配体的分数和浓度。滴定过程中弛豫速率的变化揭示，除了共享的高亲和力位点III外，IBP和SAL在HSA上的大多数低亲和力结合位点是两者共有的。本研究提供的方法可作为分析两种配体与一种蛋白质竞争性结合的替代方法。文中还讨论了分析中可能的误差来源，例如交叉弛豫的影响、外推r1b的准确性以及高亲和力结合位点可能带来的微小影响等。
本研究的科学价值在于，建立并验证了一种基于溶液态NMR弛豫测量的、无需分离的、可直接定量分析复杂体系中竞争性药物-蛋白质低亲和力相互作用的方法。相较于凝胶过滤、平衡透析、毛细管电泳等传统技术，该方法在溶液接近生理条件下进行，能够提供动态的结合信息和定量的结合参数（kd, n），尤其适用于研究具有多个低亲和力位点的体系。其应用价值在于，为预测两种或多种药物共同给药时因血浆蛋白竞争结合导致的游离药物浓度变化提供了新的实验思路和分析手段，有助于更深入地理解药物相互作用和个体化用药。
本研究的亮点包括：1. 方法创新性：将NMR弛豫测量这一物理方法创新性地应用于药物竞争性结合的定量分析，提供了一种新的研究视角和工具。2. 模型体系的巧妙选择：选用IBP和SAL这一对共享高亲和力位点且拥有大量低亲和力位点的模型药物，使得竞争性效应在低亲和力区间得以清晰展现。3. 重要的发现：通过精确的定量数据，不仅证实了竞争性结合的存在，还首次通过实验数据推断出IBP和SAL在HSA上的低亲和力结合位点部分重叠、部分特异，深化了对HSA低亲和力结合位点多样性的认识。4. 详细的误差分析：论文对实验中可能存在的误差来源（如交叉弛豫、外推精度、高亲和力位点干扰等）进行了坦诚讨论，增强了方法的可靠性和结果的严谨性。
其他有价值的内容包括论文对快速交换体系理论模型的清晰阐述，以及对可能形成的三元复合物（如ibp·hsa·sal）的简要讨论（虽未在简化模型中区分），显示了作者对体系复杂性的考量。此外，研究得到了中国国家自然科学基金、973项目和中国科学院多学科研究计划的支持，体现了该工作的重要性。