类型a：学术研究报告

作者及机构
本研究由Nancy Frank、Thomas Bessaire、Adrienne Tarres、Alexandre Goyon和Thierry Delatour共同完成，所有作者均来自瑞士洛桑的Nestlé Research Centre, Nestec Ltd.。该研究于2017年9月发表在期刊《Food Additives & Contaminants: Part A》上，标题为《Development of a quantitative multi-compound method for the detection of 14 nitrogen-rich adulterants by LC-MS/MS in food materials》。

学术背景
近年来，食品欺诈（food fraud）问题日益严重，尤其是通过添加高氮化合物人为提高食品蛋白质含量的经济驱动型掺假行为（economically motivated adulteration, EMA）。例如，2008年的三聚氰胺（melamine, MEL）事件揭示了此类掺假对食品安全和合规性的威胁。由于传统的凯氏定氮法（Kjeldahl method）无法区分内源性蛋白质氮和外源性掺假氮，因此开发一种能够同时检测多种高氮化合物的分析方法至关重要。

本研究的目标是建立一种基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的定量多化合物检测方法，覆盖14种高氮掺假物（如三聚氰胺、双氰胺、三聚氰酸等），并适用于多种食品基质（如婴儿配方奶粉、液态奶、谷物、肉类/鱼粉等）。该方法需满足快速、简单、高灵敏度的要求，并能同时检测高浓度掺假和低浓度污染水平。

研究流程
1. 化合物选择与标准品制备
- 选择14种高氮化合物（氮含量33%-67%），包括三聚氰胺（MEL）、双氰胺（DCD）、三聚氰酸（CA）等。
- 制备标准品溶液：分别配制单标储备液（0.1或1 mg/mL），再混合为4种工作液（Mix A-D），用于校准曲线和加标实验。

1. 样品前处理优化

   • 提取：1 g样品加水或含1%甲酸的水（肉类/鱼粉用纯水），均质后离心。
     
   • 净化：上清液用乙腈稀释，加入PSA（200 mg）和C18（200 mg）吸附剂进行分散固相萃取（d-SPE），去除糖类和脂质干扰。
     
   • 酸化调整：针对酸性化合物（如CA、AMD），在净化前添加甲酸以避免PSA吸附损失。
     

2. LC-MS/MS分析

   • 色谱条件：采用HILIC（亲水相互作用色谱）柱（Waters Acquity BEH Amide），流动相为含5 mM甲酸铵的乙腈/水梯度。
     
   • 质谱条件：正/负离子切换模式，多反应监测（MRM），每种化合物监测2个离子对。
     
   • 同位素内标法：使用¹³C/¹⁵N标记的内标（如¹³C₃-¹⁵N₃-MEL）校正基质效应。
     

3. 方法验证

   • 线性与灵敏度：7点校准曲线（0-40 ng/mL），定量限（LOQ）为0.05-0.20 mg/kg。
     
   • 准确度与精密度：在7类食品基质中加标（LOQ和20×LOQ），回收率70%-120%，重复性CV <20%。
     
   • 稳健性验证：在另一实验室（Lab 2）重复实验，结果一致。
     

4. 稳定性与挑战

   • 标准品稳定性：-20℃储存6个月无降解，但4℃下部分化合物（如AMD、AMN）易分解。
     
   • 干扰问题：
     
     • 双缩脲（BUR）和三缩脲（TUR）色谱分离不佳，需通过标准添加法区分。
       
     • 市售标准品纯度不足（如BUR含TUR杂质），需更换供应商（如MolPort）。
       

主要结果
1. 方法性能
- 所有化合物在7类基质中均达到LOQ要求（0.05-0.20 mg/kg），优于欧洲标准（CEN/TC 275）。
- 回收率：含同位素内标的化合物为81%-122%，无内标的化合物（如ATZ、4-AT）为54%-146%。
- 基质效应：同位素内标有效补偿，溶剂校准与基质匹配校准线性一致（R² >0.98）。

1. 实际应用
   
   • 在43种食品中未检出掺假，但发现部分样品天然含TUR（如脱脂奶粉0.32 mg/kg）。
     
   • 通过FAPAS质控样（T0352QC）验证，三聚氰胺（421 µg/kg）和三聚氰酸（570 µg/kg）的测定值与参考值一致。
     

结论与价值
本研究建立了一种高效、稳健的LC-MS/MS方法，可同时检测14种高氮掺假物，适用于复杂食品基质。其科学价值在于：
1. 方法创新：首次整合d-SPE净化和HILIC色谱，解决极性化合物分离难题。
2. 应用价值：为食品质量控制提供工具，尤其适用于乳制品和谷物等高蛋白食品的掺假筛查。
3. 行业意义：弥补现有方法的不足（如MacMahon et al. 2012仅检测8种化合物），并满足低污染水平的监管需求。

研究亮点
1. 多化合物覆盖：同时分析14种化合物，包括三聚氰胺代谢物（如AMD、AMN）和新兴掺假物（如DCD）。
2. 快速前处理：单步d-SPE净化，较传统SPE节省时间。
3. 技术优化：通过酸化调整和色谱梯度改进，解决BUR/TUR共洗脱问题。

其他价值
研究还揭示了标准品纯度和储存条件对结果的影响，为后续方法开发提供了重要参考。例如，建议使用-20℃保存标准品，并优先选择高纯度供应商（如Toronto Research Chemicals）。