第二代入肺芯片：基于生物膜的可拉伸肺泡阵列

主要作者与发表信息

该研究由Pauline Zamprogno等人完成，通讯作者为Olivier T. Guenat，来自University of Bern的Organs-on-Chip Technologies Laboratory（器官芯片技术实验室）。其他参与机构包括AlveoliX AG、Helmholtz-Institute for Pharmaceutical Research Saarland (HIPS)、Völklingen Heart Center及University Hospital of Bern。该研究发表于*Communications Biology*，文章于2020年9月14日收稿，2021年1月12日接收，DOI为10.1038/s42003-021-01695-0。

研究背景

器官芯片（organs-on-chips, OOCs）正在成为具有预测能力的组织建模工具，并被视为动物实验的可靠替代方案。这些微工程化细胞系统能够为细胞提供接近其天然体内微环境（in vivo milieu）的培养条件。在呼吸系统研究领域，第一代肺芯片（lung-on-a-chip）利用薄而可拉伸的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）膜模拟呼吸运动诱导的机械应变。然而，这些系统存在两个主要局限：其一，它们仅模拟单个肺泡，其上皮面积远大于体内真实肺泡的尺寸，无法再现肺泡网络（alveoli network）的三维几何结构；其二，PDMS膜作为一种人工基底膜（basal membrane），在小分子吸收（absorption）和吸附（adsorption）方面存在严重问题，且其分子组成和固有刚度（stiffness）与天然细胞外基质（extracellular matrix, ECM）差异显著，从而扭曲了细胞的生化微环境并影响细胞表型与稳态。鉴于肺微结构、机械力、肺泡上皮表型与肺功能之间的紧密联系，开发能够模拟肺泡阵列并采用生物源性基底膜的肺芯片成为该领域的迫切需求。本研究旨在创建第二代肺芯片，以模拟气血屏障（air–blood barrier）的关键特征：具有体内尺寸的肺泡阵列、由肺ECM蛋白（胶原蛋白和弹性蛋白）构成的可拉伸生物膜、以及该膜的可生物降解性和可调节性。

研究流程与实验方法

研究的第一阶段是生物膜的制备。研究者采用一种自下而上（bottom-up）的制造方法：将一滴胶原蛋白-弹性蛋白（collagen–elastin, CE）溶液滴加至厚度为18 µm的金网（gold mesh）上。该金网直径2 mm，包含40个规则六边形孔，六边形边长为130 µm，孔直径约260 µm，孔壁宽30 µm。CE溶液通过表面张力（surface tension force）维持在金网顶部，经37 °C凝胶化后在室温下干燥48小时。干燥过程中，胶原蛋白分子自组装为纤维（fibrils），平均直径为45.7 ± 18.9 nm。金网预先经3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和戊二醛处理以确保膜的附着。膜的厚度可通过调节滴加体积进行调控：当CE比例为1:1时，滴加体积为0.8 µL mm⁻²、1.6 µL mm⁻²和2.4 µL mm⁻²分别对应4.5 ± 0.8 µm、8.8 ± 1 µm和11.5 ± 1.2 µm的膜厚。干燥后的膜可在室温下储存至少3周，使用前在细胞培养基中再水化2小时。

第二阶段为膜的性能表征。在光学性质方面，CE膜在可见光波段的吸光度约为10%，优于聚酯（polyester, PET）膜的约20%。在可降解性评估中，将CE膜暴露于不同浓度的基质金属蛋白酶-8（matrix metalloproteinase-8, MMP-8），结果显示膜在50 U ml⁻¹浓度下1小时内完全降解，而在5 U ml⁻¹浓度下需超过6小时，降解时间与酶浓度呈反比。在分子吸收/吸附测试中，将膜浸泡于10 µM罗丹明B（rhodamine B）2小时后，CE膜所吸附的荧光分子数量比PDMS膜和PET膜低约90%（p < 0.0001）。在通透性方面，异硫氰酸荧光素-钠（FITC–sodium, 0.4 kDa）和罗丹明异硫氰酸酯-葡聚糖（RITC–dextran, 70 kDa）经4小时孵育后分别有25.0% ± 3.5%和12.3% ± 2.9%从顶侧转运至基底侧。在拉伸性能方面，通过向基底侧施加循环负压使40个六边形中的膜同时发生三维偏转。数值模拟显示，对于1:1 CE膜，在−1.0 kPa负压下径向应变达4.9% ± 0.8%，在−2.0 kPa下达9.1% ± 2.5%，而同等厚度的PDMS膜在−2.0 kPa下仅产生2.7% ± 0.5%的应变。CE膜的偏转量可通过改变胶原蛋白与弹性蛋白的比例进行调节：在−1.5 kPa下，2:1、1:1和1:3比例的膜偏转分别为31 ± 4.4 µm、38.6 ± 3.1 µm和51.3 ± 3.9 µm。经MMP-8处理45分钟后，膜在−1 kPa下的偏转从31.0 ± 2.3 µm增加至35.6 ± 3.6 µm，表明酶降解可改变膜的机械性能。

第三阶段为细胞培养实验。研究使用了来自患者健康肺组织分离的原代人肺泡上皮细胞（human alveolar epithelial cells, hAEPCs）和人肺微血管内皮细胞（human lung microvascular endothelial cells, veravec细胞）。单培养实验中，hAEPCs以270,000 cells cm⁻²或100,000 cells cm⁻²的密度接种于CE膜上。高密度接种在第2天达到汇合，细胞表面积维持在1407 ± 160 µm²；低密度接种后细胞表面积增加至2480 ± 136 µm²。细胞可在CE膜上培养至少3周。与PDMS膜不同，CE膜无需预先涂层即可促进细胞黏附。共培养实验中，先将芯片翻转，在内皮细胞侧（基底侧）接种veravec细胞，24小时后再翻转芯片并在顶侧接种hAEPCs。细胞在气液界面（air–liquid interface）培养数天仍保持汇合状态并形成功能性屏障。

第四阶段为肺泡屏障功能验证。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）成像确认了I型（type I, ATI）和II型（type II, ATII）肺泡上皮细胞的典型形态：ATI细胞扁平而细长，ATII细胞小而立方状。紧密连接（tight junctions）清晰可见，闭合小带-1（zonula occludens-1, ZO-1）在第4天和第21天均沿细胞边界表达。表面活性蛋白-C（surfactant protein-C, SP-C）和板层小体（lamellar bodies）等ATII典型标志物在第4天检出。屏障功能通过分子转运实验评估：有hAEPCs单层存在时，FITC–sodium和RITC–dextran的转运率分别降至9.4% ± 3.3%和2.1% ± 1.2%，明显低于无细胞膜的水平。该结果在来自四位患者的细胞中得到了重复验证。共培养体系中，上皮细胞和内皮细胞均达到汇合并覆盖整个肺泡阵列，TEM图像展示了CE膜夹在肺泡上皮与微血管内皮之间的完整气血屏障结构。

主要结果与结论

本研究成功开发了一种基于胶原蛋白-弹性蛋白生物膜的第二代肺芯片。该芯片的核心创新在于三个方面：其一，利用表面张力驱动的自下而上制造方法生成了悬浮的生物膜，厚度可调（最薄4.5 µm），制备过程远简单于PDMS多孔膜的光刻工艺；其二，CE膜模拟了肺实质的天然可变形ECM，兼具结构支撑和弹性回复能力，且具有可降解性；其三，通过金网支架创建了包含40个六边形小室的肺泡阵列，每个小室的尺寸（约260 µm）与体内肺泡直径（100–200 µm）处于同一量级，且膜在负压驱动下产生三维空间应变梯度，最大线性应变约10%，处于生理应变范围内。功能验证表明，原代肺泡上皮细胞和内皮细胞在CE膜上可维持汇合状态和屏障功能长达3周，细胞表现出体内典型的形态学特征和分子标志物表达。CE膜在光学透明度、小分子非特异性吸附、生物降解性及力学可调性等方面均优于PDMS膜。

研究意义与价值

该工作的科学价值在于：首次将生物源性可拉伸膜与肺泡阵列几何结构相结合，在气血屏障模型中重现了肺实质的关键结构-力学耦合特征。CE膜的可降解性为研究肺气肿、肺纤维化和肺癌等疾病中ECM重塑（remodelling）过程提供了新工具，而其力学性能的可调性使得健康与疾病状态下的细胞微环境均能被模拟。在应用价值方面，该技术有望用于药物筛选和精准医疗中的个体化治疗策略评估。此外，CE膜不吸附小分子的特性对于临床前药物测试具有重要意义，因为它能确保细胞暴露于已知浓度的药物，而PDMS膜的吸收问题会导致有效浓度难以评估。该生物膜技术还具有通用性，可扩展至其他体内屏障模型（如血脑屏障、肠屏障等）的构建。

研究亮点

本研究的突出亮点包括：（1）首次报道了可拉伸、可生物降解的胶原蛋白-弹性蛋白膜在肺芯片中的应用；（2）通过金网支架实现了体内尺寸肺泡阵列的工程化模拟；（3）CE膜的制备方法简便、可重复且可储存，具有向高通量筛选转化的潜力；（4）使用原代人肺泡上皮细胞（而非细胞系）验证了屏障功能，结果在四位患者的细胞中具有一致性，增强了模型的临床相关性。