本研究的主要作者包括Astrid Hauptmann（第一作者，来自奥地利因斯布鲁克大学物理化学研究所）、Katja Podgoršek、Drago Kuzman、Stanko Srčič、Georg Hoelzl以及通讯作者Thomas Loerting（奥地利因斯布鲁克大学物理化学研究所）。该研究于2018年3月19日在线发表于期刊 Pharm Res 上，标题为《缓冲液、蛋白质浓度及蔗糖添加对冻融过程中聚集及颗粒形成的影响》。

这项研究属于药物科学、生物物理化学及生物制药工艺领域，具体聚焦于治疗性蛋白质（特别是单克隆抗体）在冷冻和融化这一关键工艺步骤中的稳定性问题。在生物制药行业中，冻融过程常用于活性药物成分或制剂的中间储存与运输，以避免微生物生长并减缓降解反应。然而，该过程也可能对蛋白质造成损害，引发聚集、错误折叠/去折叠、生物活性丧失或增加患者的免疫反应风险。这些损害通常源于复杂的物理化学变化，如冷变性、界面吸附、以及由冰晶生长导致的溶质和蛋白质在微观与宏观尺度上的冷冻浓缩效应。尽管冻融是常规操作，但工艺参数（如降温速率）和配方组分（如缓冲液、稳定剂）对蛋白质稳定性的影响机制尚未被完全阐明，尤其是针对不同蛋白质浓度下颗粒（聚集体）形成的行为。因此，本研究旨在系统性地探究冻融速率、缓冲液配方、蛋白质浓度以及添加蔗糖作为冻干保护剂（cryoprotectant）对一种内部研发的嵌合单克隆抗体溶液稳定性的影响。其最终目标是通过深入理解冻融行为，优化工艺参数和配方，从而最大限度地减少不希望的颗粒（包括蛋白质聚集体）的形成，为生物制药产品的开发和生产提供科学依据。

研究的详细工作流程包含了多个相互关联的步骤，结合了多种分析技术来全面表征冻融过程中的物理化学变化和颗粒形成情况。 首先，研究设计了不同的冻融实验方案。 研究使用两种冻融设备来模拟不同的温度控制条件。一部分实验使用一个放置在-80°C冰柜中的“冷冻盒”。通过将装有蛋白质溶液的样品瓶置于盒子的不同位置（中间和边角），利用盒内水瓶的被动热传递，实现了不同的冷却速率。位于盒子中间的样品冷却速率较慢（约1.1 K/min），而边角的样品冷却速率较快（约3.9 K/min）。样品经历了最多5次的冻融循环（FT-cycles），以评估循环次数的影响。另一部分实验使用温度可控的Celsius®–S3台式系统，该系统使用冷却液循环精确控制温度，模拟了生产规模的冷冻协议。在这部分实验中，研究人员系统性地改变了单克隆抗体在25 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.5）中的浓度（1、10、20、30 mg/ml），并对比了添加与不添加125 mM蔗糖的配方。所有冻融后的样品均经过均质化处理，然后进行颗粒表征。 其次，研究采用了多种分析技术来评估冻融影响，可分为热力学、形态学和颗粒分析三大类。 在热力学分析方面，研究使用了差示扫描量热法（Differential Scanning Calorimetry, DSC）。DSC测量在Perkin-Elmer DSC 8000上进行。研究人员将约30 μL的样品（包括纯缓冲液、含蔗糖缓冲液以及蛋白质溶液）置于铝坩埚中，以不同的冷却速率（1、2、5、10、20、40°C/min）从10°C冷却至-90°C，随后再以相同速率加热。DSC用于测定溶液的冻结温度（T_f）、冻浓缩溶液的玻璃化转变温度（T_g’），并观察冻结和融化过程中的热事件（如结晶、冷结晶、熔化）。校准使用了环戊烷、环己烷、铟和金刚烷等标准物质，确保温度精度。 在形态学可视化方面，研究采用了光学冷显微镜（Optical Cryomicroscopy, OCM）。OCM系统将Olympus BX-51显微镜与Linkam LTS420低温台联用。研究人员将约0.5 μL的样品滴置于载物台上，覆盖盖玻片以防止蒸发，然后以与DSC实验相对应的不同冷却速率（1至40°C/min）冷却至-80°C。使用交叉偏振光观察冰晶的形成、大小、取向以及冷冻浓缩液相的分布。升温过程也被记录，以观察融化行为。OCM直观地揭示了冷冻速率对冰晶形态和溶质分布（微观冷冻浓缩）的影响。 在颗粒分析方面，研究使用了三种互补的技术来覆盖从纳米到微米级的颗粒尺寸范围。微流成像（Micro Flow Imaging, MFI） 用于检测和计数尺寸在2至300 μm范围内的颗粒。样品以恒定流速通过流动池，CCD相机捕获颗粒图像，软件分析颗粒的数量、大小和形态。阿基米德系统（Archimedes） 用于检测尺寸在200 nm至5 μm范围内的亚微米颗粒。该技术基于共振质量测量原理，能够高灵敏度地计数小颗粒。动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS） 用于测量纳米至亚微米尺度（约1-800 nm）的颗粒尺寸分布和流体力学直径，并计算多分散指数（Polydispersity Index, PDI），以评估样品的均一性或聚集程度。 数据工作流程 遵循逻辑顺序：首先通过DSC和OCM理解冻融过程中的基础物理化学变化（热事件、形态变化）；然后利用MFI、Archimedes和DLS对不同冻融条件和配方处理后的样品进行颗粒定量和表征；最后将物化变化数据与颗粒形成数据相关联，以解释其背后的机制。

研究的主要结果详实，揭示了多个关键影响因素及其相互作用。 关于冻融循环和冷却速率的影响，MFI数据显示，对于1 mg/ml不含蔗糖的蛋白质溶液，每一次额外的冻融循环都会导致颗粒数量显著增加，表明反复的冻融应力对蛋白质造成了累积损伤。更重要的是，样品在冷冻盒中的位置（即冷却速率）起到了关键作用。经过5次循环后，位于盒子边角（快速冷却）的样品颗粒数量远高于中间位置（慢速冷却）的样品。然而，慢速冷却样品的颗粒平均直径更大。这表明慢速冷却导致形成更少但更大的冰晶，进而可能产生更少但更大的蛋白质聚集体；而快速冷却产生更多、更小的冰晶和界面，引发了更多但可能更小的颗粒形成。这一发现强调了控制冷却速率对于管理颗粒数量和大小分布的重要性。 关于蛋白质浓度和蔗糖添加的影响，Archimedes和MFI的联合数据揭示了一个有趣的现象。随着蛋白质浓度从1 mg/ml增加至30 mg/ml，由Archimedes检测到的小颗粒（<5 μm）数量增加，而由MFI检测到的大颗粒（>2 μm）数量却减少。这表明在高浓度下，蛋白质分子更倾向于形成小尺寸的聚集体或簇，而不是生长成可见的大颗粒。蔗糖的作用则表现出两面性。在低蛋白浓度（1 mg/ml）下，添加蔗糖反而增加了Archimedes检测到的小颗粒数量，并且DLS数据显示PDI急剧升高（从0.005升至0.193），表明体系多分散性增加，可能发生了蔗糖或蛋白质/蔗糖复合物的异质聚集。然而，在高蛋白浓度（30 mg/ml）下，添加蔗糖减少了MFI检测到的大颗粒数量（减少约三分之一），显示出明确的冻干保护剂效果。DLS数据进一步支持了这一观察：对于10 mg/ml及以上的样品，添加蔗糖使蛋白质的流体力学直径增加了约1 nm（例如，30 mg/ml样品从16.2 nm增至17.1 nm），这可能是由于蔗糖通过“优先排阻”机制改变了蛋白质的水合层，导致蛋白质分子之间发生了轻微的可逆结合或紧凑化，但阻止了它们进一步聚集形成大的不溶性颗粒。研究得出结论：蔗糖的冻干保护效果仅在较高的蛋白质浓度（>10 mg/ml）下显现，而在低浓度下可能因糖/蛋白比例不当而产生负面影响。 关于冷冻浓缩和热力学行为，OCM和DSC的结果提供了直观和定量的机制解释。OCM图像显示，不含蔗糖的缓冲液在慢速冷却（1-2°C/min）下形成大的冰晶片层，溶质被排挤到冰晶间的通道（“叶脉”）中，造成宏观和微观的冷冻浓缩。快速冷却（30-40°C/min）则导致更小、更密集的冰晶网络，溶质分布相对更均匀。添加蔗糖后，冷冻样品的形态发生显著变化：溶液在冻结后呈现不透明状，交叉偏振光下显示均匀的绿色或星状图案。星状图案表明冰晶从一个或少数几个成核点向外生长，这得益于蔗糖抑制了异相成核。DSC数据提供了关键的热力学参数。研究发现，添加蔗糖将溶液的玻璃化转变温度T_g’从约-40°C（快速扫描下测得）提高至约-32°C，表明冻浓缩溶液中的蔗糖浓度约为70 wt%。更重要的是，只有在含有蔗糖且以慢速（1-5°C/min）冷却时，DSC冷却曲线上才会出现第二个冻结放热峰。这对应于冻浓缩溶液本身的结晶（而非玻璃化）。OCM观察证实，这一“二次冻结”事件导致在更低温度下样品形态变得更加均匀。相反，在不含蔗糖或快速冷却条件下，冻浓缩溶液直接玻璃化。在升温过程中，不含蔗糖的缓冲液在约-10°C至-6°C范围内出现一个微小的放热峰，被解释为冷结晶——即玻璃态的冻浓缩溶液在升温经过T_g’后，其中的溶质发生结晶。这一现象在添加蔗糖的样品中被完全抑制，说明蔗糖能有效防止冻融过程中潜在的有害结晶事件。

基于上述结果，本研究得出结论：治疗性蛋白质溶液的冻融是一个复杂的过程，其优化需要综合考虑多个因素。为最大程度减少蛋白质聚集和颗粒形成，最佳策略是避免多次冻融循环，并采用较慢的冷冻速率（约1-2°C/min）。虽然慢速冷冻会产生较少但较大的颗粒，但从质量控制和免疫原性风险角度看，控制颗粒总数可能更为关键。蔗糖作为冻干保护剂，其效果具有浓度依赖性，在高蛋白浓度（>10 mg/ml）下能有效减少大颗粒的形成并抑制冷结晶，但在低蛋白浓度下可能适得其反。因此，寻找最佳的蛋白质与稳定剂比例对于配方开发至关重要。较高的蛋白质浓度本身在抑制大颗粒形成方面显示出优势。本研究还揭示了蔗糖影响冻融行为的物理化学机制：它不仅提高了冻浓缩相的T_g’，还在慢速冷却条件下诱导了冻浓缩相的二次结晶，从而可能改变了局部微环境，影响了蛋白质的稳定性。

本研究的亮点在于其系统性和多技术联用的研究方法。它并非孤立地考察单个参数，而是将冻融速率、循环次数、蛋白质浓度和配方组分（蔗糖）等多个变量置于同一研究框架内，揭示了它们之间复杂的相互作用。通过将DSC/OCM揭示的热力学和形态学机制，与MFI/Archimedes/DLS表征的颗粒结果直接关联，研究建立了从分子/微观尺度变化到宏观产品质量属性（颗粒）之间的清晰逻辑链条。特别是关于蔗糖保护作用的浓度依赖性以及其在慢速冷却下引发冻浓缩相二次结晶的发现，增进了对冻干保护剂作用机制的理解，具有重要的科学价值。

此外，研究还对一些现象进行了有价值的讨论。例如，高蛋白浓度下流体力学直径的增加被归因于“负动态相互作用参数”和蔗糖的优先排阻效应共同导致的扩散受限和轻微聚集。研究也承认其结论可能具有产品特异性，不同单克隆抗体的行为可能有所不同，强调了在工艺开发中进行类似系统性研究的必要性。这项工作为生物制药行业优化单克隆抗体及其他治疗性蛋白质的冻融工艺和配方开发提供了详实的实验数据和深刻的理论见解。