一、 研究团队与发表信息
本项研究由中国多所顶尖研究机构的学者合作完成。第一作者为Long Liu（刘龙）、Yuhao Ba（巴宇皓）、Shuaixi Yang（杨帅熹）、Aning Zuo（左阿宁）和Shutong Liu（刘书彤），他们共同分享了第一作者身份。通讯作者为Xinwei Han（韩新巍）、Zhenyu Hou（侯震宇）和Zaoqu Liu（刘灶渠），其所在单位分别为郑州大学第一附属医院介入放射科、山东大学齐鲁医院普通外科以及郑州大学第一附属医院介入放射科/中国医学科学院基础医学研究所。合作单位还包括西安交通大学第一附属医院、中国医学科学院肿瘤医院、郑州大学医学院、南方医科大学珠江医院、中南大学湘雅医院、伦敦国王学院等国内外知名机构。
该研究以题为“FOS-driven inflammatory CAFs promote colorectal cancer liver metastasis via the SFRP1-FGFR2-HIF1 axis”的研究论文形式，发表于国际知名学术期刊《Theranostics》2025年第15卷第10期。该期刊采用开放获取模式，论文于2025年3月21日正式在线发表。
二、 研究学术背景
结直肠癌是全球致死率第二高的恶性肿瘤，其死亡率中约90%归因于癌症转移，而肝脏是结直肠癌最常见的转移部位。结直肠癌肝转移是一个动态过程，受到肿瘤微环境中细胞间相互作用的深刻调控。肿瘤相关成纤维细胞是肿瘤微环境中无处不在的间质细胞，在癌症转移中发挥着多样且关键的功能，包括基质产生与重塑、血管生成等。然而，传统的认知将CAFs视为一个相对同质的群体。随着单细胞RNA测序技术的发展，CAFs的显著异质性被揭示，出现了诸如基质CAFs、炎性CAFs、抗原呈递CAFs和血管CAFs等不同亚型。这种高度异质性意味着不同的CAF亚型可能在结直肠癌肝转移中发挥独特的作用。但迄今为止，究竟是哪些特定的CAF亚型驱动了肝转移，以及它们促进这一过程的具体分子机制，在很大程度上仍是未知的。
此外，CAFs的“可塑性”（即其根据微环境信号改变表型和功能的能力）是理解其在肿瘤进展中动态作用的关键。转录因子是驱动CAFs可塑性和功能维持的核心。尽管单细胞测序部分揭示了CAFs的异质性，但调控CAFs可塑性、驱动其向特定促转移亚型分化的机制尚不清楚。因此，系统性地鉴定在结直肠癌肝转移中起关键作用的特定CAF亚型，阐明其上游调控机制和下游效应分子，并揭示其与癌细胞相互作用的详细信号通路，对于全面理解CAFs在转移中的作用和开发靶向治疗策略至关重要。
基于上述背景，本研究旨在通过整合单细胞转录组、空间转录组等多组学分析，结合体外和体内功能实验模型，深入探究CAFs在结直肠癌肝转移中的具体角色、关键亚型及其作用机制。
三、 详细研究流程
本研究采用了从临床数据分析到基础实验验证，再到体内模型确认的综合性、多步骤研究策略，流程严谨且系统。
第一步：临床样本单细胞与空间转录组学分析，鉴定关键CAF亚型。 * 研究对象与样本量： 研究团队收集并整合了三个公开的结直肠癌单细胞RNA测序数据集（GSE144735， GSE178318， GSE200997）。经过质控和筛选，最终纳入了来自原发性结直肠癌组织的45，141个细胞。这些样本被分为两组：无肝转移的原发肿瘤（CRCP）和有肝转移的原发肿瘤（CRCM）。此外，还从SCCRLM图谱获取了4对匹配的原发灶和肝转移灶患者的10x Visium空间转录组数据，包含31，203个组织点位。 * 数据处理与分析方法： 使用Seurat软件包进行标准化的单细胞数据处理，包括质控（去除低质量细胞和双细胞）、归一化、主成分降维。采用Harmony算法校正批次效应。通过无监督聚类和已知的细胞标记基因（如CAFs标记为COL1A1， COL3A1， DCN）对细胞进行注释。随后，专门对CAFs群体进行亚群重聚类，根据差异表达基因、经典标记分子（如CFD， POSTN， MMP3）和功能富集分析，鉴定出包括炎性CAFs在内的多个亚群。使用CellChat工具推断细胞间通讯网络。利用Monocle2和Cytotrace进行拟时序轨迹分析和细胞分化潜能评估。通过SCENIC（单细胞调控网络推断和聚类）分析鉴定CAF亚群中活跃的转录因子及其调控网络。对于空间转录组数据，使用SpaGene等工具分析配体-受体共定位情况。 * 主要发现： 分析显示，与无转移患者相比，有肝转移患者的肿瘤中CAFs比例下降，但其功能从以细胞外基质重塑为主转变为以炎症反应为主。进一步细分CAFs亚群后，发现一个特定的CFD+ 炎性CAFs亚群在肝转移患者中比例显著升高，且与不良预后、晚期肿瘤分期以及上皮-间质转化活性高度正相关。空间转录组证实该亚群与肿瘤EMT区域紧密相邻。
第二步：鉴定CFD+ 炎性CAFs的关键效应分子。 * 研究方法： 通过比较CRCM和CRCP中CFD+ 炎性CAFs的差异表达基因，筛选出高表达的分泌蛋白编码基因。结合蛋白质-蛋白质相互作用网络分析、与EMT/转移活性的相关性分析，以及公共数据库（如TCGA）中基因表达与CAFs浸润丰度的关联分析，锁定候选分子。 * 主要发现： SFRP1 和 GPX3 被鉴定为在CFD+ 炎性CAFs中特异性高表达，且在肝转移样本中表达更高的分泌蛋白。其中，SFRP1的表达尤为突出。对包含104例结直肠癌患者的组织芯片进行免疫组化分析，证实SFRP1蛋白高表达与患者总生存期缩短和晚期肿瘤分期显著相关。多重免疫荧光也验证了SFRP1在肝转移组织中的高表达。
第三步：探究CFD+ 炎性CAFs分化及SFRP1表达的上游调控机制。 * 研究方法： 利用拟时序分析描绘CAFs亚群的分化轨迹。通过SCENIC分析获得的转录因子调控网络，识别在CFD+ 炎性CAFs中特异性活跃的转录因子。结合公共的FOS ChIP-seq数据，预测FOS的靶基因。通过染色质免疫沉淀-定量PCR实验和双荧光素酶报告基因实验，在分子水平验证FOS对SFRP1启动子的直接结合和转录激活作用。在体外，使用小干扰RNA敲低或过表达载体上调小鼠原代CAFs中FOS的表达，通过Western Blot和qPCR检测SFRP1水平的变化。 * 主要发现： 拟时序分析表明CFD+ 炎性CAFs处于分化轨迹的末端。SCENIC分析显示，转录因子 FOS 在CFD+ 炎性CAFs中具有最高的调控特异性得分。ChIP-qPCR和荧光素酶报告基因实验证实FOS直接结合并激活SFRP1基因的启动子。体外功能实验证明，敲低FOS可降低CAFs中SFRP1的表达，而过表达FOS则能上调SFRP1。这表明 FOS驱动了CFD+ 炎性CAFs的分化并促进其分泌SFRP1。
第四步：体外验证SFRP1的促癌功能。 * 研究对象与方法： 使用人源结直肠癌细胞SW480和小鼠源结直肠癌细胞CT26。实验设置多组进行交叉验证：1) PBS对照组；2) 重组人源SFRP1蛋白处理SW480细胞；3) 重组鼠源SFRP1蛋白处理CT26细胞；4) 用稳定过表达SFRP1的小鼠原代CAFs的条件培养基处理CT26细胞。通过细胞集落形成实验、Transwell迁移/侵袭实验、肿瘤球形成实验评估细胞的增殖、迁移、侵袭和干性。通过免疫荧光染色和Western Blot检测干性标记物（CD44， CD133）和EMT相关蛋白（E-cadherin， N-cadherin， Vimentin， ZEB1）的表达。 * 主要发现： 无论是外源性添加重组SFRP1蛋白，还是用分泌SFRP1的CAFs条件培养基处理，均能显著增强结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力，促进肿瘤球形成（干性增强），并上调干性标记物和间质标记物的表达，同时下调上皮标记物E-cadherin的表达。这证实了CAFs来源的SFRP1能有效促进肿瘤细胞的干性和EMT。
第五步：体内验证SFRP1的促转移作用。 * 研究模型与方法： 构建了多种临床前动物模型：1) 皮下移植瘤模型：将SW480细胞接种于裸鼠皮下，瘤内注射重组SFRP1蛋白或PBS对照。2) 患者来源类器官模型 和 患者来源异种移植模型：从结直肠癌患者新鲜组织中建立，并用重组SFRP1处理。3) 原位结直肠癌肝转移模型：将预先与过表达SFRP1的CAFs或对照CAFs共培养的CT26细胞，原位注射到BALB/c小鼠的盲肠壁，模拟自发肝转移过程。使用活体生物发光成像监测肝转移灶，通过组织学染色和免疫组化分析原发瘤和转移瘤的病理特征、干性及EMT标志物。 * 主要发现： 在皮下瘤、PDO和PDX模型中，SFRP1处理均能显著促进肿瘤生长。在原位模型中，与对照CAFs共培养组相比，与SFRP1过表达CAFs共培养的小鼠，其原发肿瘤更大、更重，肝脏转移灶的数量和体积显著增加。原发瘤和转移瘤中干性标志物（CD44， CD133）和EMT标志物表达上调，增殖标志物Ki67表达增强。这强有力地证明了CAFs分泌的SFRP1在体内能驱动结直肠癌的原位生长和肝转移。
第六步：阐明SFRP1的作用受体及下游信号通路。 * 研究方法： 采用免疫沉淀-质谱联用技术，在SW480细胞中寻找与重组SFRP1蛋白直接相互作用的蛋白。通过蛋白质相互作用网络分析和功能富集，筛选关键受体。利用分子对接和分子动力学模拟预测SFRP1与候选受体的结合模式和稳定性。通过空间转录组分析验证配体-受体在组织中的共定位。通过免疫共沉淀实验验证蛋白质间的直接结合。为了探究下游机制，对经CAFs条件培养基处理的癌细胞进行RNA测序，通过基因集富集分析筛选受影响的信号通路。最后，在体外和体内模型中，通过敲低候选受体或使用特异性抑制剂阻断下游通路，验证其在SFRP1功能中的必要性。 * 主要发现： IP-MS及后续分析鉴定出成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2） 是SFRP1的关键相互作用蛋白。Co-IP实验证实了SFRP1与FGFR2的直接结合。分子模拟显示两者能形成稳定的复合物。RNA-seq和GSEA分析表明，SFRP1处理激活了HIF1信号通路。TCGA数据分析显示SFRP1表达与缺氧评分、干性评分正相关。功能挽救实验证明，在癌细胞中敲低FGFR2，或使用HIF1通路抑制剂Echinomycin处理，能够完全逆转SFRP1所诱导的增殖、迁移、侵袭、干性增强及EMT表型。在体内，敲低FGFR2或抑制HIF1通路也能有效抑制SFRP1驱动的肿瘤生长和肝转移。
四、 主要研究成果
本研究通过层层递进的分析与验证，取得了以下核心发现：
鉴定出结直肠癌肝转移的关键CAF亚型：通过整合多中心单细胞数据，发现CFD+ 炎性CAFs在伴有肝转移的结直肠癌患者中比例显著升高，且其基因特征与患者不良预后和晚期分期紧密相关。该亚群的功能特征从传统的基质重塑转向炎症反应，并与肿瘤的EMT活性在空间上高度共定位，提示其是驱动转移的潜在关键间质细胞。
揭示CFD+ 炎性CAFs的上游调控者：拟时序和转录调控网络分析表明，该亚群处于CAFs分化的特定阶段。转录因子FOS被确定为CFD+ 炎性CAFs的核心调控因子，其直接结合并转录激活下游效应分子SFRP1的基因启动子，从而驱动了这一促转移亚型的形成和功能发挥。
确定SFRP1为关键的促转移效应分子：SFRP1被鉴定为CFD+ 炎性CAFs特异性高分泌的蛋白。临床样本分析显示，SFRP1的高表达是结直肠癌患者预后不良的独立危险因素。系统的体外和体内实验证实，CAFs来源的SFRP1能显著增强结直肠癌细胞的干性、EMT、增殖、迁移和侵袭能力，并最终促进肝转移的发生。
阐明SFRP1发挥作用的具体分子机制：研究首次发现SFRP1作为配体，能够直接与癌细胞表面的FGFR2受体结合。这一相互作用并非通过经典的Wnt通路（SFRP1的已知功能），而是激活了FGFR2下游的HIF1信号通路。该通路的激活进而上调一系列与肿瘤干性和EMT相关的基因表达，构成了完整的 “SFRP1-FGFR2-HIF1”促转移信号轴。关键性功能挽救实验（敲低FGFR2或抑制HIF1）证实了该轴心是SFRP1发挥促转移功能所必需的。
这些结果逻辑严密，从临床现象（肝转移患者CAF亚群变化）出发，到关键亚型和分子（CFD+ iCAFs， SFRP1）的鉴定，再到上游调控（FOS）和下游机制（FGFR2-HIF1轴）的阐明，最后在多种临床前模型中得到功能验证，形成了一个完整、闭合的证据链。
五、 研究结论与意义
本研究得出结论：在结直肠癌微环境中，转录因子FOS驱动形成了具有促转移特性的CFD+ 炎性CAFs亚群。该亚群通过过量分泌SFRP1，与肿瘤细胞表面的FGFR2受体结合，进而激活HIF1信号通路，最终增强肿瘤细胞的干性和上皮-间质转化，导致结直肠癌肝转移的发生与发展。
本研究具有重要的科学价值与应用前景： 1. 深化对肿瘤微环境的认知：突破了将CAFs视为同质群体的传统观点，精确指出了在结直肠癌肝转移中起主导作用的具体CAF亚型（CFD+ iCAFs），并详细描绘了其从转录调控（FOS）到效应分泌（SFRP1）再到与癌细胞互作（FGFR2-HIF1轴）的完整生物学路径，为理解肿瘤-间质相互作用的复杂性提供了新范式。 2. 揭示新的促转移信号轴：发现了SFRP1通过FGFR2激活HIF1通路这一非经典的新功能，拓展了人们对SFRP家族蛋白和FGFR信号在癌症中作用的认识，为结直肠癌转移的分子机制增添了新的重要内容。 3. 提供潜在的诊断标志物和治疗靶点：SFRP1作为分泌蛋白，且在患者血清或组织中可能易于检测，其与不良预后的强关联性使其具备成为预测结直肠癌肝转移风险或预后的生物标志物的潜力。更重要的是，SFRP1、FGFR2或HIF1信号通路中的关键节点，均可作为干预结直肠癌肝转移的潜在治疗靶标。针对该轴的抑制剂（如FGFR2抑制剂或HIF1抑制剂）可能为抑制转移提供新的策略。
六、 研究亮点