PD-1H (VISTA)在系统性及皮肤性红斑狼疮自身免疫抑制中的作用——Han等人2019年《Science Translational Medicine》研究报告
第一， 主要作者、机构、发表期刊及时间 本项研究由Xue Han和Matthew D. Vesely担任共同第一作者，Lieping Chen为通讯作者，主导团队主要来自耶鲁大学（Yale University）的免疫生物学系、皮肤病学系、病理学系、遗传学系及医学系等多个部门。研究成果以研究论文（Research Article）的形式，于2019年12月11日发表于国际知名期刊 《Science Translational Medicine》 上，论文具体引用信息为：Han et al., Sci. Transl. Med. 11, eaax1159 (2019)。
第二， 研究的学术背景：科学领域、研究动机、背景知识与研究目标 本研究属于自身免疫性疾病，特别是红斑狼疮发病机制与治疗探索领域。系统性红斑狼疮（Systemic Lupus Erythematosus, SLE）和盘状红斑狼疮（Discoid Lupus Erythematosus, DLE）是累及多器官或皮肤的慢性自身免疫病，其发病与进展的关键因素尚不明确，临床治疗（尤其是DLE）手段匮乏。
研究背景基于以下认知：1）包括PD-1在内的免疫检查点分子在维持外周免疫耐受中至关重要，其缺失会导致狼疮样自身免疫。2）PD-1H（又称VISTA, VSIR），是B7/CD28家族的一个细胞表面抑制性分子，在T细胞和髓系细胞上表达。既往研究表明，PD-1H可作为抗原呈递细胞（APCs）上的抑制性配体或T细胞上的抑制性受体来调节免疫反应，但其在自身免疫病，特别是红斑狼疮中的具体作用和治疗潜力尚不清楚。3）不同遗传背景的PD-1H基因敲除（KO）小鼠表现出不一致的自发自身免疫表型，提示其作用可能受遗传背景影响。
因此，本研究旨在：1）阐明PD-1H在红斑狼疮（特别是皮肤型）发病机制中的作用；2）探索以PD-1H为靶点的激动剂疗法对狼疮的治疗潜力；3）分析PD-1H在人类SLE和DLE患者中的表达情况，以验证其临床相关性。
第三， 详细的研究工作流程 本研究设计缜密，包含多个相互关联的实验流程，综合运用了基因工程动物模型、组织病理学、流式细胞术、质谱流式细胞术（Mass Cytometry）、分子生物学、蛋白质检测以及临床样本分析等多种技术手段。
流程一：构建并表征Balb/c背景PD-1H基因敲除（KO）小鼠的自发狼疮模型。 * 研究对象： 将C57BL/6背景的PD-1H KO小鼠回交至Balb/c背景10代，获得纯合的Balb/c PD-1H KO小鼠及其野生型（WT）同窝对照。主要使用雌性小鼠进行观察和分析。 * 研究方法与实验： 1. 临床表型观察： 长期观察小鼠皮肤病变（斑块、脱毛、红斑、鳞屑、眶周水肿）的发生率和严重程度。 2. 组织病理学分析： 对皮肤、心脏、肾脏进行苏木精-伊红（H&E）染色，评估炎症细胞浸润、表皮增生、溃疡等特征，并与人类DLE和MRL/lpr（经典狼疮模型小鼠）的病变进行组织学比较。使用Von Kossa染色检测心包钙化。 3. 血清学检测： 通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中的抗核抗体（ANA）、抗双链DNA（dsDNA）抗体以及炎症细胞因子（如IL-6, MCP-1）水平。 4. 免疫细胞表型分析： 通过流式细胞术分析脾脏和淋巴结中免疫细胞的数量和亚群变化，包括T细胞（CD4+, CD8+）、B细胞、自然杀伤（NK）细胞、髓系细胞（CD11b+）、浆细胞样树突状细胞（pDCs）、滤泡辅助性T细胞（Tfh）以及调节性T细胞（Tregs）和效应记忆T细胞的比例。 * 数据与样本量： 涉及大量小鼠（例如，皮肤病变发生率统计：雌性WT n=62， KO n=66），结果以发病率曲线、组织学评分、抗体滴度箱线图等形式呈现。
流程二：探究PD-1H KO小鼠皮肤狼疮病变的免疫微环境特征。 * 研究对象： PD-1H KO小鼠的皮肤病变组织、外观正常的皮肤，以及WT对照小鼠的皮肤。 * 研究方法与实验： 1. 免疫组织化学（IHC）： 使用针对CD3（T细胞）、CD11b（髓系细胞）、CD317/pDCA-1（pDCs）等标志物的抗体对皮肤切片进行染色，定量分析浸润免疫细胞的类型和数量，并特别关注了pDCs的簇状聚集这一人类DLE的特征。 2. 质谱流式细胞术（CyTOF）： 这是本研究的关键技术亮点之一。该技术使用金属同位素标记抗体，能够同时检测超过40个参数，且背景信号极低。研究人员从皮肤组织中分离出CD45+免疫细胞，使用包含大量表面和细胞内标志物的抗体面板进行标记，然后通过质谱仪检测，以超高维度解析皮肤病变中复杂的免疫细胞组成。特别关注了不同年龄段（4月龄无症状期和6月龄发病期）小鼠皮肤中免疫浸润的动态变化。 3. 基因表达谱分析： 提取皮肤组织RNA，使用I型干扰素刺激基因（ISGs）PCR阵列，分析PD-1H缺失对I型干扰素通路相关基因表达的影响。 4. 体外细胞功能实验： 从骨髓中分离中性粒细胞，用脂多糖（LPS）刺激，检测其产生IL-6、TNF-α、MCP-1等炎性因子的能力，比较WT和KO来源中性粒细胞的炎症潜能。 * 数据与样本量： IHC进行定量计数；CyTOF数据通过viSNE降维可视化并量化各细胞亚群百分比（如中性粒细胞占CD45+细胞的比例）；基因表达数据以火山图和热图展示。
流程三：验证PD-1H在人类狼疮样本中的表达。 * 研究对象： 存档的人类皮肤活检石蜡包埋（FFPE）组织样本，包括DLE（n=21）、扁平苔藓（Lichen Planus, LP, n=11，作为另一种炎症性皮肤病对照）和正常对照皮肤（n=20）。以及公共数据库（Omicsoft Diseaseland）中SLE患者（n=111）和健康对照（n=25）的外周血RNA测序数据。 * 研究方法与实验： 1. 免疫组织化学（IHC）： 对上述人类皮肤组织进行PD-1H、CD3、CD4、CD8、CD68（巨噬细胞）、CD123（pDCs）、髓过氧化物酶（MPO，中性粒细胞）等染色，量化比较PD-1H阳性细胞及其他免疫细胞在各组中的数量。 2. 多重定量免疫荧光（MQIF）与自动定量分析（AQUA）： 这是另一项先进的分析技术。通过对同一组织切片进行多重荧光标记（PD-1H与CD3、CD8、CD11b、CD68等共标），并采用AQUA算法进行定量，可以精确测定特定细胞亚群（如CD3+ T细胞）内PD-1H蛋白的表达水平，而不仅仅是细胞计数。 3. 生物信息学分析： 从公共数据库中提取PD-1H基因（C10orf54）的表达数据，比较SLE患者与健康人外周血免疫细胞中的转录水平。
流程四：评估PD-1H激动剂抗体在MRL/lpr狼疮模型中的治疗效果。 * 研究对象： 雌性MRL/lpr小鼠，一种自发发展为严重系统性狼疮（包括皮肤病变、肾炎、淋巴增生）的经典模型。 * 研究方法与实验： 1. 治疗方案： 从6周龄开始，每周向小鼠腹腔注射200 μg的PD-1H激动性单克隆抗体（mAb，克隆号MH5A）或同型对照IgG，直至16周龄。 2. 疗效评估： * 临床评分： 定期监测并评分皮肤病变的严重程度（脱毛、红斑、糜烂/溃疡、范围）。 * 组织病理学： 治疗结束时取皮肤和肾脏进行H&E染色和IHC（CD3, CD11b, pDCs），评估病变改善情况。 * 血清学检测： ELISA检测ANA、抗-dsDNA、抗-Ro52等自身抗体水平。 * 细胞因子阵列： 检测血清中31种细胞因子/趋化因子的水平。 * 免疫表型分析： 流式细胞术分析淋巴结和脾脏中T细胞、B细胞、中性粒细胞、pDCs、Tfh等免疫细胞的数量变化。 * 尿液分析： 检测蛋白尿水平。 * 数据与样本量： 每组约10只小鼠，结果以生存曲线、临床和组织学评分、抗体和细胞因子水平、细胞计数等展示。
流程五：探究PD-1H发挥抑制功能的细胞与分子机制。 * 研究对象： 从小鼠脾脏或淋巴结分离的CD4+ T细胞、pDCs和中性粒细胞。 * 研究方法与实验： 1. PD-1H作为配体的机制： 用PD-1H-Fc融合蛋白与活化的CD4+ T细胞共孵育，通过磷酸化流式细胞术（Phospho-flow）检测T细胞受体（TCR）下游信号通路分子（如p-Akt, p-p70 S6K, p-ERK1/2）的磷酸化水平。 2. PD-1H作为受体的机制： * 在T细胞上： 用激动剂抗体MH5a刺激活化的WT或PD-1H KO CD4+ T细胞，通过Phospho-flow检测TCR信号通路的变化。 * 在髓系细胞上： * pDCs： 分离pDCs，在MH5a或对照IgG存在下，用TLR7/8激动剂R848刺激，检测上清中IFN-α的产量以及细胞表面CD86、MHC II的表达。 * 中性粒细胞： 分离中性粒细胞，在MH5a或对照IgG存在下，用LPS刺激，检测上清中IL-1β、TNF-α、MCP-1等炎性因子的产量。 3. 体内验证： 在Pristane（烃油，可诱导狼疮样关节炎和自身抗体）腹腔注射模型中，给予MH5a或对照IgG，检测腹腔液中募集中性粒细胞和单核/巨噬细胞的数量。 * 数据与样本量： 体外实验通常进行至少三次独立重复，数据以平均荧光强度（MFI）或细胞因子浓度表示。
第四， 研究的主要结果 结果一： Balb/c PD-1H KO小鼠自发产生了与人类狼疮高度相似的皮肤和系统性自身免疫病。约36%的雌性KO小鼠在6月龄时出现皮肤红斑狼疮样病变，其组织学特征（如pDCs簇状聚集）与人类DLE高度相似，而WT小鼠极少发病。KO小鼠还伴随心包钙化发生率升高、血清ANA和抗-dsDNA抗体（尤其在发病小鼠中）水平随年龄增长而升高，以及IL-6和MCP-1等炎性因子水平上升。免疫表型分析显示KO小鼠次级淋巴器官中CD4+ T细胞、NK细胞、CD11b+髓系细胞、pDCs和Tfh细胞增多，效应记忆T细胞比例增加而外周Tregs减少，表明全身免疫系统过度激活。
结果二： PD-1H缺失导致I型干扰素反应增强。PD-1H KO小鼠在给予TLR7/8激动剂后，血清IFN-α水平更高，其pDCs体外产生IFN-α的能力也更强。皮肤组织基因表达谱显示，KO小鼠皮肤（包括外观正常部位）中一部分ISGs表达上调，提示存在亚临床炎症和I型干扰素通路激活。
结果三： 中性粒细胞是PD-1H KO小鼠皮肤狼疮病变中最丰富且最早的浸润免疫细胞。 这是本研究的一个关键发现。CyTOF分析揭示，在已建立的皮肤病变中，中性粒细胞（CD11b+Ly6G+Ly6C+）可占浸润CD45+免疫细胞的50-80%。更重要的是，在4月龄尚未出现临床病变的KO小鼠外观正常皮肤中，中性粒细胞浸润已显著早于并多于WT小鼠，而T细胞等浸润并未增加。此外，KO来源的中性粒细胞经LPS刺激后，产生IL-6、TNF-α和MCP-1的能力更强。这些结果将PD-1H的功能与中性粒细胞的炎症调控直接联系起来，并提示中性粒细胞在皮肤狼疮起始中可能扮演关键角色。
结果四： PD-1H缺失加剧了Pristane诱导的狼疮/关节炎模型。PD-1H KO小鼠在注射Pristane后，关节炎发生率更高、发病更早、更严重，关节内中性粒细胞浸润更明显，同时腹膜腔招募的中性粒细胞更多，血清ANA和抗组蛋白抗体水平也更高。这进一步证实PD-1H具有限制中性粒细胞介导的炎症和自身免疫反应的作用。
结果五： PD-1H在人类SLE和DLE中表达上调。 IHC和MQIF/AQUA分析显示，与正常皮肤或LP相比，DLE病变中PD-1H阳性细胞（包括CD3+ T细胞、CD8+ T细胞、CD11b+髓系细胞和CD68+巨噬细胞）数量显著增加，且这些细胞内的PD-1H蛋白表达水平也更高。生物信息学分析证实，SLE患者外周血免疫细胞中PD-1H基因的mRNA表达高于健康对照。这为PD-1H作为人类狼疮治疗靶点提供了直接的临床依据。
结果六： PD-1H激动剂抗体可有效改善MRL/lpr小鼠的狼疮病情。 用激动剂MH5a治疗显著延迟了皮肤病变的发生、降低了病变的临床和组织学严重程度、减少了皮肤中CD11b+髓系细胞的浸润。在系统层面，治疗降低了ANA、抗-dsDNA和抗-Ro52自身抗体水平，减轻了淋巴结病（减少T细胞、中性粒细胞、pDCs和Tfh细胞），并下调了血清中IFN-α、IL-1α等多种促炎细胞因子/趋化因子。虽然蛋白尿有所减少，但对狼疮肾炎的组织学改善不显著，提示治疗可能存在器官特异性效应。
结果七： PD-1H既可作为抑制性配体也可作为抑制性受体在T细胞和髓系细胞上传递抑制信号。 机制研究表明：1）PD-1H-Fc作为配体可抑制T细胞TCR下游的mTORC1/2和MAPK（ERK1/2）信号通路。2）MH5a抗体作为PD-1H受体激动剂，可抑制T细胞上的MAPK（ERK1/2）信号。3）更重要的是，本研究首次明确证实PD-1H在髓系细胞（中性粒细胞和pDCs）上也可作为抑制性受体发挥作用：MH5a处理能抑制pDCs的激活和IFN-α产生，并能抑制中性粒细胞在LPS刺激下释放IL-1β、TNF-α和MCP-1。这些效应均依赖于细胞自身表达的PD-1H。
第五， 研究的结论、意义与价值 结论： 本研究综合证明，免疫抑制性分子PD-1H是红斑狼疮（尤其是皮肤型）发病和进展中的一个关键调控因素。其功能缺失会导致自发狼疮样疾病，其特征是中性粒细胞驱动的早期炎症和pDCs的异常激活。在人类狼疮中，PD-1H在病变部位高表达，可能代表一种代偿性的抑制反馈。通过激动剂抗体激活PD-1H信号通路，能够有效抑制T细胞和髓系细胞（中性粒细胞、pDCs）的功能，从而在动物模型中缓解皮肤和系统性的狼疮症状。
科学价值： 1）揭示了PD-1H在维持皮肤和系统免疫稳态、防止狼疮自发发生中的不可或缺的作用。2）首次将PD-1H的功能与中性粒细胞在自身免疫病中的致病角色紧密联系起来，并指出中性粒细胞可能是皮肤狼疮的早期驱动因素。3）拓展了对PD-1H生物学功能的认识，首次明确其在髓系细胞上作为抑制性受体的功能。4）建立了Balb/c PD-1H KO小鼠作为一个新的、能更好模拟人类DLE pDCs簇状聚集特征的皮肤狼疮自发模型。
应用价值： 研究为红斑狼疮，特别是目前缺乏FDA批准疗法的盘状红斑狼疮，提出了一种全新的治疗策略：即使用PD-1H激动剂进行免疫治疗。这为开发靶向PD-1H的激动性抗体药物用于临床狼疮治疗提供了强有力的临床前证据和理论依据。
第六， 研究的亮点 1. 重要发现： 明确了PD-1H缺失导致自发狼疮，并首次将PD-1H的抑制功能与中性粒细胞在皮肤狼疮中的核心浸润地位联系起来。 2. 研究方法的创新性与特殊性： 综合运用了前沿的质谱流式细胞术（CyTOF）和多重定量免疫荧光（MQIF/AQUA）技术，实现了对复杂组织免疫微环境的高维度、精确定量解析，这是获得关键发现（如中性粒细胞最早浸润）的技术保障。 3. 研究对象的特殊性： 构建了Balb/c背景的PD-1H KO小鼠，获得了稳定且能模拟人类DLE关键病理特征（pDCs簇状聚集）的自发狼疮模型，优于部分传统模型。 4. 转化医学价值突出： 不仅深入探讨了机制，还通过成熟的狼疮模型（MRL/lpr）完整验证了PD-1H激动剂的治疗效果，并证实了其在人类患者样本中的靶点相关性，完整演绎了从基础机制到治疗探索的转化研究路径。
第七， 其他有价值的内容 研究也指出了自身的局限性，例如：PD-1H激动剂治疗改善狼疮的确切细胞靶点和完整分子机制尚未完全阐明；小鼠模型（以髓系细胞浸润为主）与人类DLE（以T细胞浸润为主）在免疫浸润主体上存在差异，提示物种间机制可能存在不同；PD-1H表达的调控机制未知。这些都为后续研究指明了方向。此外，研究还讨论了PD-1H在肿瘤免疫和自身免疫中可能具有不同的表达模式，提示未来使用PD-1H阻断剂治疗癌症时，需要关注其对不同自身免疫病的潜在影响。