关于导管原位癌风险分层中循环肿瘤细胞作为预测性生物标志物研究的学术报告

本研究由来自美国密歇根大学、堪萨斯大学医学中心等多个机构的Neha Nagpal、Brittany Rupp、Yan Hong等学者共同完成，通讯作者为Sunitha Nagrath教授与Fariba Behbod教授。该研究成果以研究论文的形式，于2025年10月29日发表在《科学·进展》（*Science Advances*）期刊上。

一、 学术背景与研究目的

本研究属于癌症研究，特别是乳腺癌早期检测与预后生物标志物领域。导管原位癌（Ductal Carcinoma in Situ, DCIS）是乳腺癌的非强制性前驱病变，约占所有乳腺癌诊断的20-25%。虽然被称为“0期”癌，但仍有10-53%的病例会在未治疗情况下进展为浸润性癌。目前，DCIS的治疗（如手术、放疗、内分泌治疗）存在明显的过度治疗问题，其根源在于缺乏可靠的预后生物标志物来精准识别哪些患者具有高进展风险。此外，已有研究在DCIS患者的骨髓中检测到播散性肿瘤细胞（Disseminated Tumor Cells, DTCs），这挑战了“肿瘤细胞必须先在原发灶发生浸润才能扩散”的传统观点，并提出了“早期播散”的假说：癌细胞亚克隆可能在临床可察觉的浸润发生之前，就已从原位癌原发灶播散出去。

本研究旨在探索循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cells, CTCs）作为DCIS患者生物学侵袭性及早期播散指示生物标志物的潜力。CTCs是进入血液循环的肿瘤细胞，被认为是转移的种子。通过研究CTCs，有望实现对DCIS患者的风险分层，识别出需要更积极系统治疗的高危患者，同时避免对低危患者的过度治疗，从而改善临床决策。

二、 研究详细工作流程

本研究设计周密，整合了临床样本分析、单细胞测序和动物模型验证，主要包含以下关键步骤：

1. 临床样本收集与处理： 研究队列包括34名DCIS患者（中位年龄61岁）和10名健康对照。在患者手术前采集外周血样本，并使用特殊的细胞保存管（CellRescue tubes）运送至实验室。同时，从患者手术标本中获取匹配的肿瘤组织。

2. CTC的富集与鉴定：

   • 富集方法： 采用名为“迷宫”（Labyrinth）的抗原非依赖性微流控芯片技术富集CTCs。该技术利用癌细胞与白细胞在大小和刚性上的物理差异，无需依赖于特定的表面抗原（如EpCAM），可捕获不同表型的癌细胞。患者血液样本经过Ficoll密度梯度离心去除红细胞后，在迷宫芯片中以2500 μL/min的流速处理两次，最终从特定出口收集富集了CTCs的细胞群。
   • 鉴定与计数： 对富集后的细胞进行免疫荧光染色，CTCs被定义为DAPI（核染色）阳性、PanCK（广谱细胞角蛋白，上皮细胞标志物）阳性、CD45（白细胞共同抗原）阴性的细胞。通过显微镜成像对每毫升血液中的CTC进行计数和确认。

3. 单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析：

   • 样本选择： 从上述患者中选取了6名患者（DCIS 4, 12, 14, 15, 17, 25）的富集CTC样本及其匹配的福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixation Paraffin-Embedding, FFPE）组织样本进行深度分析。
   • 组织处理： 将FFPE组织切片解交联、消化，制备成单细胞悬液。
   • 测序与数据分析： 使用10x Genomics平台进行单细胞转录组测序。生信分析流程包括：使用CCA方法整合不同样本数据；通过UMAP进行细胞聚类；利用已知的乳腺上皮细胞亚型标记基因（如LumHR, LumSec, Basal）对上皮细胞进行分类；使用inferCNV软件从scRNA-seq数据推断拷贝数变异（Copy Number Variation, CNV），以识别肿瘤细胞（具有高CNV负荷）；进行差异基因表达分析和基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）以揭示不同细胞群体的功能通路特征；使用CellChat软件预测细胞间配体-受体相互作用网络。

4. 小鼠导管内模型验证：

   • 模型构建： 使用Behbod课题组此前建立的“小鼠导管内”（Mouse IntraDuctal, MIND）模型。该模型将来自DCIS患者组织的上皮细胞注入免疫缺陷小鼠的乳腺导管内，可模拟DCIS的发生与发展过程。
   • CTC监测： 在MIND模型建立后的第4、6、12个月，采集小鼠血液，使用相同的迷宫芯片技术和免疫荧光染色方案检测和计数CTCs，旨在验证在病理学上仍处于“浸润前”阶段时，是否已有癌细胞进入循环系统（即早期播散）。

三、 主要研究结果

1. DCIS患者中存在可检测的CTCs，且其数量与种族差异相关：

   • 在34名DCIS患者中，76%（26/34）的患者检测到了CTCs。患者组的CTC中位数为6.1个/毫升血液，显著高于健康对照组的0.92个/毫升。
   • 受试者工作特征曲线分析表明，CTC计数可以有效区分DCIS患者与健康对照。
   • 关键发现： 在患者队列内部，黑人患者（n=6）的CTC中位数（16个/毫升）显著高于白人患者（n=28，中位数5个/毫升）。而DCIS的组织学分级（Grade）或HER2状态在本队列中并未导致CTC数量出现显著差异，这提示CTC可能捕捉到传统病理指标之外的风险信息。

2. 单细胞转录组揭示DCIS组织及CTCs的异质性：

   • 组织分析： 在DCIS组织中鉴定出四种主要上皮细胞亚型：两种管腔激素反应型（LumHR）、一种基底型和一种管腔分泌型（LumSec）。其中，一个特定的LumHR2亚群高表达与进展和干细胞特性相关的基因（如ERBB2, BCL9），且该亚群主要来自HER2阳性的患者样本。通过inferCNV识别出的肿瘤细胞（高CNV负荷）与正常上皮细胞相比，其差异表达基因富集于被抑制的免疫调节通路，这一现象在不同种族组中均存在。
   • CTC分析： 从血液中富集并测序的CTCs主要来源于组织的Basal或LumHR2亚型。CTCs与血液中其他细胞相比，其差异表达基因显示血小板活化和聚集通路被激活，而淋巴细胞介导的免疫调节通路被抑制，这支持了CTC通过血小板包裹以在循环中存活的假说。CTCs表现出上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）的中间态特征。与组织肿瘤细胞相比，CTCs的细胞外基质构建相关通路被抑制。

3. 克隆进化分析支持“进化瓶颈”模型：

   • 通过比较匹配的组织肿瘤细胞和CTCs的CNV谱，发现其一致性程度因患者而异。例如，DCIS 25的患者二者CNV谱高度一致，而DCIS 12患者的CTCs则有许多独特的CNV。
   • 重要发现： 在某些病例中，组织内存在大量遗传异质性的亚克隆（如DCIS 15有超过10个亚克隆），但进入循环的CTCs却只来自极少数的亚克隆（如仅1-3个）。这种组织内亚克隆多样性与CTC亚克隆单一性之间的鲜明对比，为 “进化瓶颈”模型提供了证据：即只有具备特定遗传特性（如与迁移、存活相关）的少数克隆能够突破基底膜进入血液循环。

4. 细胞通讯网络分析揭示CTCs的免疫交互特征：

   • 在组织微环境中，Basal和LumHR2上皮细胞是最活跃的信号发送和接收者。
   • 在循环微环境中，CTCs与单核细胞、NK细胞、血小板等免疫细胞存在频繁的预测性配体-受体相互作用。
   • CTCs与组织中的LumHR2细胞共享一些配体-受体对（如APP-CD74），但也具有独特的相互作用（如PF4-CXCR3与浆细胞），表明CTCs在适应循环环境时调整了其细胞通讯模式。

5. MIND模型证实早期播散：

   • 在MIND模型中，在模型仍处于组织学上的“浸润前”阶段时（最早在建模后4个月），即成功检测到了CTCs。这一结果在活体水平上直接支持了“早期播散”假说，即癌细胞在获得明显的局部浸润能力之前，已具备进入血液循环的潜力。

四、 结论与意义

本研究得出结论：循环肿瘤细胞（CTCs）可作为导管原位癌（DCIS）的一种有前景的预后生物标志物。研究证实了在DCIS患者外周血中可稳定检测到具有恶性遗传特征（CNV）的CTCs，其来源与原发性DCIS肿瘤相关。单细胞水平的分子特征分析揭示了CTCs的异质性、其与免疫微环境的相互作用以及与肿瘤进展相关的通路激活。更重要的是，研究通过患者样本分析和MIND动物模型，为乳腺癌发生发展过程中的“早期播散”假说提供了有力证据。

本研究的价值在于： * 科学价值： 深化了对DCIS生物学行为的理解，挑战了传统的线性进展模型，强调了肿瘤细胞播散可能是一个更早期的事件。为乳腺癌转移的起始机制研究提供了新视角。 * 临床价值/应用潜力： 提出了一种基于液体活检（CTC检测与分子分型）的无创或微创风险分层工具。未来有望用于识别那些具有高进展和转移风险的DCIS患者，从而指导个体化治疗（如对高危患者尽早使用辅助系统治疗），同时避免对低危患者的过度治疗，最终实现改善患者预后和降低医疗负担的目标。

五、 研究亮点

1. 研究对象创新： 首次在DCIS患者中系统性地将CTCs与原发肿瘤组织在单细胞转录组层面进行匹配比较研究，填补了该领域的空白。
2. 技术方法整合： 将抗原非依赖性的高通量微流控CTC富集技术、高分辨率单细胞RNA测序、生物信息学克隆分析以及高度模拟人DCIS进程的MIND动物模型有机结合，构成了一个完整、多层次的研究体系。
3. 重要发现：
   • 揭示了DCIS患者CTC存在显著的种族差异（黑人患者CTC数量更高），并发现其CTCs具有独特的免疫抑制特征，这可能部分解释了乳腺癌预后中的种族差异。
   • 通过CNV谱比较，为肿瘤细胞早期播散过程中的 “进化瓶颈”选择模型 提供了直接的人类数据支持。
   • 在临床前动物模型中直接观察到浸润前阶段的CTC，为“早期播散”假说提供了关键实证。
4. 转化前景明确： 研究明确指向了CTC分析作为DCIS风险分层和预后监测工具的临床转化路径，为后续开展更大规模的前瞻性临床研究奠定了坚实基础。

六、 其他有价值的内容

研究还尝试将已发表的基于DCIS组织的812基因风险分类器（可预测5年同侧复发风险）应用于CTCs。发现在部分患者（如DCIS 12）的CTCs中，该分类器的多个基因显著上调，提示未来可通过监测CTC中此类风险基因的表达来评估进展风险。这进一步拓展了CTC作为“实时”风险监测指标的潜力。作者也指出了当前研究的局限性，如缺乏与单细胞测序样本对应的MIND模型进行直接关联，以及对照组样本量相对较小，并明确了未来扩大样本量、深入研究种族差异机制以及探索CTC功能（如转移定植能力）的研究方向。