学术研究报告：外泌体circPOLQ通过激活IL-10/STAT3轴促进结直肠癌模型中巨噬细胞M2极化的机制研究

一、研究团队与发表信息
本研究由Zhenqiang Sun（郑州大学第一附属医院）、Yanxin Xu、Bo Shao等共同完成，通讯作者包括Zhenqiang Sun、Jinbo Liu、Yang Liu和Junhong Hu。研究于2024年5月6日发表在*Journal for Immunotherapy of Cancer*（J Immunother Cancer 2024;12:e008491），采用开放获取模式（Open Access），遵循CC BY-NC非商业性再利用许可协议。

二、学术背景
结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的远处转移是导致患者预后不良的主要原因，约15%-25%的病例在初诊时已发生转移。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中的肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）是关键的免疫调节细胞，其M2型极化表型（免疫抑制性）与CRC进展密切相关。然而，肿瘤细胞如何通过外泌体（exosomes）传递信号分子调控TAMs极化的机制尚不明确。

circRNA（环状RNA）是一类具有稳定环状结构的非编码RNA，近年研究发现其可通过外泌体介导细胞间通讯。本研究旨在揭示CRC细胞来源的外泌体circPOLQ如何通过调控巨噬细胞极化促进肿瘤转移，为CRC的预后标志物和靶向治疗提供新策略。

三、研究流程与方法
1. circPOLQ的鉴定与临床关联分析
- 样本：6对CRC组织与癌旁正常组织的测序数据，28例手术切除的CRC患者组织（含13例转移和15例非转移）。
- 方法：高通量测序筛选差异表达的circRNA；RNA原位杂交（ISH）和免疫组化（IHC）验证circPOLQ与CD163（M2标志物）的表达相关性；生存分析评估circPOLQ的预后价值。
- 关键实验：
- 通过发散/收敛引物和放线菌素D处理验证circPOLQ的环状结构稳定性（半衰期长于线性POLQ）。
- 核质分离和荧光原位杂交（FISH）显示circPOLQ主要定位于细胞质。

1. 外泌体circPOLQ的功能机制

   • 外泌体分离与鉴定：超速离心法从HCT116和SW620细胞系中提取外泌体，纳米颗粒追踪（Nanosight）和透射电镜确认其形态（直径30-150 nm），Western blot检测标志蛋白TSG101和CD9。
     
   • 巨噬细胞极化实验：
     
     • 用PMA诱导THP-1单核细胞分化为M0巨噬细胞，与CRC外泌体共培养后，通过qPCR、流式细胞术和Western blot检测M2标志物（CD206、CD301、IL-10）的表达。
       
     • 荧光标记（PKH67）外泌体示踪其被巨噬细胞内化的过程。
       

2. 分子机制解析

   • miR-379-3p/IL-10/STAT3轴验证：
     
     • 双荧光素酶报告实验证实circPOLQ直接结合miR-379-3p，而miR-379-3p靶向抑制IL-10的3’UTR。
       
     • RNA pull-down实验验证circPOLQ与miR-379-3p的相互作用。
       
     • Western blot显示circPOLQ通过IL-10激活STAT3磷酸化（p-STAT3），促进M2极化。
       

3. 体内实验验证

   • 转移模型：
     
     • 肝/肺转移模型：将经外泌体处理的SW480细胞（低转移性CRC细胞）通过脾脏或尾静脉注射至NSG小鼠，30天后活体成像（IVIS）观察转移灶，H&E染色和IHC分析EMT标志物（N-cadherin、Vimentin）。
       
     • 原位CRC模型：将HCT116过表达circPOLQ的细胞与巨噬细胞混合注射至盲肠壁，6周后评估原位肿瘤和远处转移。
       

四、主要研究结果
1. circPOLQ的临床意义
- circPOLQ在CRC组织中高表达，且转移灶中表达更高（ISH H-score验证），与患者不良预后显著相关（p<0.0001）。

1. 外泌体介导的巨噬细胞重编程

   • CRC外泌体可被巨噬细胞内化，circPOLQ敲低后，巨噬细胞M2标志物（CD206、IL-10）表达下降50%以上（qPCR和流式验证）。
     
   • 共培养实验显示，M2巨噬细胞的条件培养基显著增强SW480细胞的迁移和侵袭能力（Transwell实验，p<0.001），且EMT标志物（ZEB1、N-cadherin）上调。
     

2. 分子机制

   • circPOLQ通过吸附miR-379-3p解除其对IL-10的抑制，激活STAT3信号通路（p-STAT3水平增加2倍）。
     
   • 回复实验：过表达IL-10或抑制miR-379-3p可逆转circPOLQ敲低对M2极化的抑制作用。
     

3. 体内验证

   • 过表达circPOLQ的HCT116细胞在原位模型中导致更早的肝转移（IVIS荧光强度增加3倍），且转移灶中CD163+ M2巨噬细胞浸润增加（IHC验证）。
     

五、研究结论与价值
1. 科学意义：首次揭示CRC外泌体circPOLQ通过miR-379-3p/IL-10/STAT3轴驱动巨噬细胞M2极化，为TME中肿瘤-免疫细胞互作提供了新机制。
2. 应用价值：circPOLQ可作为CRC转移的潜在预后标志物，靶向阻断外泌体circPOLQ或IL-10/STAT3通路可能成为抑制转移的新策略。

六、研究亮点
1. 创新性发现：
- 阐明外泌体circRNA调控TAMs极化的完整信号轴。
- 结合临床样本与多组学分析，验证circPOLQ的预后价值。
2. 技术方法：
- 建立原位CRC转移模型，模拟人类肿瘤微环境互作。
- 通过RNA pull-down和双荧光素酶报告实验精确解析ceRNA机制。

七、其他价值
研究数据已通过在线补充材料公开（DOI:10.1136/jitc-2023-008491），包括测序原始数据、实验步骤和引物序列，为后续研究提供参考。