这是一份关于一项原创性研究的学术报告。
一、研究基本信息
该研究题为《天然细胞补丁：黑色素纳米颗粒用于通过减弱巨噬细胞焦亡实现磁共振成像引导的抗动脉粥样硬化治疗》（Natural Cell Patches: Melanin Nanoparticles for MR Imaging-Guided Antiatherosclerosis Therapy via Attenuating Macrophage Pyroptosis），于2023年发表在期刊《Advanced Functional Materials》上。研究的主要完成单位是南京大学医学院附属金陵医院（Affiliated Jinling Hospital, Medical School of Nanjing University）的放射科（Department of Radiology），通讯作者为Longjiang Zhang博士。共同第一作者包括Ziyue Zu、Jie Sheng和Jianchen Qi。
二、研究背景与目的
动脉粥样硬化（atherosclerosis）是导致主要不良心血管事件（MACCE）的主要原因，是全球范围内死亡的重要构成部分。除了传统的脂质蓄积风险因素外，即使进行标准降脂治疗，MACCE的残余风险仍然很高，这凸显了对新疗法的需求。目前，炎症（inflammation）已被广泛认为是动脉粥样硬化发病机制的关键因素。
焦亡（pyroptosis）是一种特殊的程序性细胞死亡形式，其特征是炎症小体（inflammasome）的组装与激活、细胞膜Gasdermin D（GSDMD）孔道的形成，以及炎症细胞因子（如白细胞介素-1β，IL-1β）的快速释放，因此也被称为“炎性细胞死亡”。在众多能形成炎症小体的模式识别受体中，NLR家族吡啶结构域包含蛋白3（NLRP3）因其能识别多种刺激而显得尤为独特，且大量证据表明NLRP3炎症小体在动脉粥样硬化发病中起关键作用。过度激活的血管内巨噬细胞、内皮细胞和平滑肌细胞的焦亡会加速动脉粥样硬化进程并诱发斑块破裂，进而导致MACCE。
尽管靶向炎症的治疗策略已显示出心血管获益，但全身性抗炎治疗可能导致脱靶毒性、免疫抑制甚至致命感染。因此，针对NLRP3依赖性焦亡的精准治疗策略亟待开发。近年来，天然多酚类化合物在抑制NLRP3炎症小体方面表现出色。黑色素（melanin）作为一种天然多酚生物聚合物，其制成的纳米颗粒（MNPs）已被证实可作为出色的纳米抗氧化剂，在活性氧（ROS）相关或炎性疾病中具有治疗价值，但在通过减弱NLRP3依赖性焦亡来治疗动脉粥样硬化方面的潜力尚未被评估。
基于此，本研究旨在开发一种基于天然黑色素的多功能纳米平台，用于MR成像引导的动脉粥样硬化治疗，并探索其通过靶向并减弱巨噬细胞焦亡来发挥抗动脉粥样硬化作用的机制。
三、研究流程与方法
本研究可分为纳米平台的构建与表征、体外细胞实验、体内动物实验三个主要部分。
在纳米平台构建阶段，研究者首先通过自组装方法制备了超小（约5.2纳米）的普通黑色素纳米颗粒（MNPs）。为改善生物相容性并赋予靶向能力，通过席夫碱反应和迈克尔加成，将双氨基聚乙二醇（NH2-PEG2000-NH2）接枝到MNPs上，得到NH2-PEG-MNPs（NPMPS）。随后，进一步将能特异性靶向斑块新生血管上αvβ3整合素的环肽cRGD（cyclo-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Lys）连接到纳米颗粒上，制备出具备斑块靶向能力的cRGD-PEG-MNPs（RPMPS）。为了赋予其磁共振成像（MRI）能力，研究者利用黑色素上酚羟基与钆离子（Gd3+）的强螯合作用，制备了无螯合剂的Gd3+标记的RPMPS（Gd3+-RPMPS），用于体内T1加权MR成像。整个制备过程通过透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等多种手段进行了系统表征。
在体外细胞实验阶段，研究者首先使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）验证了NPMPS和RPMPS的良好生物相容性。接着，以氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）处理的巨噬细胞（即泡沫细胞，foam cell）为模型，评估了罗丹明B标记的RPMPS的细胞摄取效率，并利用共聚焦显微镜和流式细胞术进行定性和定量分析。为研究RPMPS的抗焦亡效果，研究者使用脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞作为焦亡模型。通过检测细胞内活性氧（ROS）水平（使用DCFH-DA探针）、焦亡通路相关蛋白（NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（caspase 1）、GSDMD、IL-1β）的表达水平（通过免疫印迹法，Immunoblot），以及细胞上清液中炎症因子（IL-1β、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α））的分泌量（通过酶联免疫吸附测定法，ELISA），全面评价了RPMPS对焦亡的抑制作用。此外，还检测了自噬相关蛋白LC3的表达，以探究其潜在机制。
在体内动物实验阶段，研究者构建了载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠动脉粥样硬化模型（喂养高脂饮食12周）。通过尾静脉注射罗丹明B标记的NPMPS和RPMPS，在不同时间点处死小鼠，采集主动脉和主要器官，利用活体成像系统（IVIS）进行离体荧光成像，评估纳米颗粒的靶向效率和生物分布。在MR成像研究中，将ApoE-/-小鼠随机分组，分别注射Gd-DTPA、Gd3+-NPMPS或Gd3+-RPMPS，使用9.4T超高场强显微磁共振扫描仪进行长达48小时的动态T1加权成像，并通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）量化各器官的钆含量。在治疗研究中，将经过12周高脂喂养的ApoE-/-小鼠随机分为四组，分别给予生理盐水、辛伐他汀（灌胃）、NPMPS（尾静脉注射）或RPMPS（尾静脉注射），每3天给药一次，持续21天。治疗结束后，通过主动脉整体油红O染色（en face Oil Red O staining）、主动脉弓切片组织学分析（苏木精-伊红染色、油红O染色、Masson三色染色）、血清生化指标检测、以及免疫组织化学和免疫荧光染色，全面评估RPMPS对斑块发展的影响和对焦亡的抑制效果。
四、主要研究结果
1. 纳米平台性能： 成功制备了大小约为9.3纳米、表面电位约为-22.5毫伏的RPMPS。Gd3+-RPMPS在水溶液和完全培养基中48小时内释放的Gd3+少于1%，表现出高稳定性。在9.4T MR扫描仪上，Gd3+-NPMPS的纵向弛豫率（r1）值为4.46 mM⁻¹s⁻¹，是临床造影剂Gd-DTPA（2.65 mM⁻¹s⁻¹）的近两倍，展现出更优的T1加权成像增强性能。
2. 体外实验结果： NPMPS和RPMPS在高达400 µg/mL的浓度下仍对HUVECs显示低毒性（细胞存活率>90%）。靶向性研究显示，泡沫细胞对RPMPS的摄取量显著高于NPMPS，平均荧光强度（MFI）约为后者的四倍，证实了cRGD肽修饰的主动靶向能力。在抗焦亡实验中，RPMPS处理能有效清除LPS刺激的巨噬细胞内的ROS。更为关键的是，RPMPS显著下调了NLRP3、caspase 1和GSDMD（焦亡的执行者）的蛋白水平，并显著降低了上清液中IL-1β（降低约10倍）、IL-6（约12倍）和TNF-α（约2倍）的浓度。这些结果有力地证明了RPMPS能够在体外有效抑制LPS诱导的经典焦亡通路。
3. 体内靶向与成像结果： 离体荧光成像显示，注射后24小时，RPMPS在ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块处有显著积累，其荧光信号与油红O染色的斑块区域高度重合，量化后单位斑块面积的辐射效率约为NPMPS组的两倍，显示出优异的斑块靶向和驻留能力。在9.4T MR活体成像中，注射Gd3+-RPMPS的ApoE-/-小鼠，其主动脉斑块在注射后24小时信号达到峰值，并持续增强超过48小时，呈现出“先减弱后增强”的独特时间-信号曲线，这与小分子Gd-DTPA和被动靶向的Gd3+-NPMPS的快进快出模式形成鲜明对比，表明Gd3+-RPMPS对斑块具有持久的主动靶向和滞留能力。这与离体荧光和ICP-MS结果相互印证，后者显示48小时后主动脉内Gd3+-RPMPS的摄取量是Gd3+-NPMPS的1.5倍、Gd-DTPA的5倍。
4. 体内治疗效果： 经过21天治疗，RPMPS组小鼠的主动脉整体斑块面积较盐水组显著减少13.3%，效果优于NPMPS组和辛伐他汀组。主动脉弓横截面组织学分析进一步揭示，RPMPS治疗不仅减少了斑块面积和脂质含量，还显著增加了纤维帽厚度和胶原含量，表明其能改善斑块稳定性，将易损斑块向稳定斑块转变。血清学检查发现，RPMPS治疗还降低了甘油三酯（TG）水平，升高了高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平，并改善了肝肾功能指标（天冬氨酸转氨酶（AST）、肌酐（CREA）、尿酸（UA））。
5. 体内抗焦亡机制验证： 对主动脉组织切片的分析显示，RPMPS治疗显著降低了斑块区域的ROS水平，下调了NLRP3和GSDMD的表达，并减少了IL-1β的生成，这表明其在体内有效抑制了NLRP3介导的焦亡。同时，RPMPS治疗组小鼠血清中抗炎细胞因子白细胞介素-4（IL-4）水平升高近三倍，主动脉内M2型（抗炎型）巨噬细胞标志物CD206与M1型（促炎型）标志物iNOS的比值增加，表明RPMPS诱导了主动脉局部的抗炎表型极化。
五、研究结论与价值
本研究首次报道了将天然多酚黑色素作为治疗诊断一体化的抗焦亡纳米平台，用于MR成像引导的动脉粥样硬化治疗。RPMPS如同“细胞补丁”一样，通过清除ROS并下调NLRP3/caspase 1/GSDMD信号通路，有效抑制了巨噬细胞焦亡。在体内，RPMPS通过cRGD肽介导的主动靶向和EPR效应，高效蓄积于动脉粥样硬化斑块，不仅能提供长达48小时的持久T1-MRI增强信号，还能显著减缓斑块进展、增强斑块稳定性，并诱导抗炎微环境。其科学价值在于揭示了黑色素作为抗焦亡药物在心血管疾病治疗中的新机制，为动脉粥样硬化和其他焦亡相关疾病提供了全新的治疗思路。其应用价值在于，该平台集靶向成像与治疗功能于一体，并且展现出保护肝肾功能的额外益处，具有广阔的临床转化潜力。
六、研究亮点
本研究的主要亮点包括：（1）功能创新：首次将天然黑色素纳米颗粒应用于动脉粥样硬化的抗焦亡治疗，并阐明了其作为“天然细胞补丁”的独特作用机制。（2）平台设计：通过cRGD肽修饰，实现了对斑块新生血管的主动靶向，结合黑色素本身的ROS清除和金属螯合能力，构建了一个多功能、无螯合剂标记的诊疗一体化纳米平台。（3）影像技术：使用9.4T超高场强显微MR进行活体成像，不仅获得了高分辨率图像，还捕捉到Gd3+-RPMPS在斑块内独特的长期滞留动力学特征，为纳米药物在体评估提供了精细的技术范例。（4）疗效发现：证实了靶向抗焦亡治疗不仅能减少斑块负荷，更重要的是能够增加纤维帽厚度、改善斑块组成，即促进易损斑块的稳定，这对于预防急性心血管事件具有核心临床意义。