一项基于双信号放大的免标记电化学传感器用于灵敏检测阿尔茨海默病生物标志物Aβ寡聚体
一、 研究团队与发表信息
本研究由廖先就（右江民族医学院药学院）、张才益（徐州医科大学附属徐州东方医院）、施志强、施恒亮（徐州医科大学药学院）、钱勇（东华理工大学）和高丰雷（徐州医科大学药学院）共同完成。通讯作者为钱勇和高丰雷。该研究成果以“Signal-on and label-free electrochemical detection of amyloid β oligomers based on dual amplification induced hemin/G-quadruplex formation”为题，于2020年8月27日在线发表于国际学术期刊《Journal of Electroanalytical Chemistry》（第878卷，文章编号114604）。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于生物传感与分析化学领域，具体聚焦于神经退行性疾病生物标志物的高灵敏检测技术开发。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的慢性神经退行性疾病，其病理特征与β淀粉样蛋白（Amyloid β, Aβ）的异常聚集密切相关。传统观点认为，不溶性的Aβ纤维斑块是致病主因。然而，近年来的研究日益表明，可溶性的Aβ寡聚体（Aβ oligomers, AβO）才是导致神经元毒性和疾病发生发展的主要毒性物种，其浓度与疾病严重程度相关，因此被视为AD早期诊断的关键生物标志物。然而，AβO具有不稳定、易瞬变且异质性高等特点，对其进行高灵敏、高特异性检测面临巨大挑战。
当前检测Aβ物种的方法（如荧光免疫分析、酶联免疫吸附测定（ELISA）等）虽然有效，但通常存在需要标记、设备笨重、操作复杂且成本较高等局限性。因此，开发一种更灵敏、简便且经济的检测方法对于AD的早期诊断和病程监测具有重要的临床需求。
近年来，适配体（Aptamer）作为识别元件在生物传感领域展现出巨大潜力。与抗体相比，适配体具有合成简单、稳定性好、易于修饰和设计灵活等优点。已有研究筛选出针对AβO的特异性DNA适配体。本研究旨在利用该适配体，构建一种新型的“信号开启”（signal-on）型、免标记的电化学适配体传感器。其核心策略是通过结合两种核酸扩增技术——核酸外切酶III（Exonuclease III, Exo III）辅助的DNA循环扩增和滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA），实现检测信号的多级放大，从而实现对AβO的超灵敏检测。研究目标是为AD的早期诊断提供一个高灵敏度、高选择性、操作相对简便的分析工具。
三、 详细研究流程与方法
本研究的工作流程是一个精心设计的、多步骤的生物传感与信号放大过程，主要包含以下几个关键程序：
1. 传感界面的构建与目标物识别： 研究以金电极（Gold Electrode, GE）作为传感平台。首先，将一端修饰有巯基（-SH）的分子信标探针H2通过金-硫键自组装固定在金电极表面。H2探针设计为具有3‘突出末端（3’ overhang）的发夹结构。同时，设计了一条包含两个功能域的适配体探针H1：区域I（红色部分）是特异性识别AβO的适配体序列；区域II（黑色部分）与H1自身部分序列互补，形成一个封闭的发夹结构，将识别域I“锁定”。当目标物AβO存在时，其与H1的适配体区域I（区域I）结合，形成AβO/H1复合物。这一结合事件导致H1的发夹结构被打开，暴露出其区域II。暴露的区域II能够与电极表面固定的捕获探针H2的特定序列杂交，形成一个双链DNA结构。重要的是，这个新形成的双链结构在H2一端产生了一个平末端（3‘-blunt end），而这个结构正是Exo III发挥酶切活性的底物。
2. 第一级信号放大：Exo III辅助的DNA循环扩增： Exo III是一种能够从双链DNA的平末端或凹陷末端（recessed end）的3‘羟基端逐步切割单核苷酸的酶。当上述H2/H1（区域II）双链形成后，Exo III识别并切割H2探针，将其水解。H2的切割导致AβO/H1复合物从电极表面释放出来。释放出的AβO/H1复合物可以继续与电极表面另一个完整的H2探针结合，再次形成双链，并再次被Exo III切割。这个过程循环往复，一个AβO分子可以触发多个H2探针的切割，实现了对目标物的第一次信号放大。经过此步骤，电极表面留下了大量被切割后剩余的H2片段。
3. 第二级信号放大：滚环扩增（RCA）： Exo III切割产生的H2片段，其剩余部分被设计为RCA反应的引物（Primer）。研究人员向体系中加入一个环状的DNA模板（Padlock probe）。在T4 DNA连接酶的作用下，引物（H2片段）与环状模板杂交并被连接，形成闭合的环状模板-引物复合物。随后，加入phi29 DNA聚合酶和脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），启动RCA反应。phi29 DNA聚合酶具有强大的链置换和持续合成能力，它以环状模板为模板，以引物为起点，不断地进行复制，产生一条包含成千上万个重复单元的长单链DNA产物。这些重复序列被精心设计为包含能够形成G-四链体（G-quadruplex）的结构域。
4. 信号产生与读取： RCA反应产生的长链DNA产物上含有大量重复的G-四链体序列单元。随后，向体系中加入氯化血红素（Hemin）。Hemin是Fe(III)离子与卟啉环的复合物，它能够特异性地嵌入到G-四链体的结构中，形成具有过氧化物酶活性的Hemin/G-四链体DNA酶（DNAzyme）。更重要的是，Hemin中的Fe(III)/Fe(II)电对可以进行可逆的氧化还原反应，从而产生电化学信号。由于每个AβO分子通过两级放大（Exo III循环和RCA）最终在电极表面引入了大量G-四链体单元，进而结合了大量的Hemin分子，使得最终的电化学信号得到极大增强。研究人员采用差分脉冲伏安法（Differential Pulse Voltammetry, DPV）来检测Hemin在约-0.36 V（vs. Ag/AgCl）处产生的还原峰电流，该电流强度与初始AβO的浓度成正比。
5. 实验参数优化与性能表征： 为了获得最佳检测性能，研究团队系统优化了多个实验参数，包括：dNTPs浓度、Exo III用量、phi29 DNA聚合酶用量、Hemin浓度、Exo III反应时间、RCA反应时间、孵育温度和pH值。通过监测不同条件下DPV响应电流的变化，确定了各参数的最优值（例如：dNTPs 5 mM， Exo III 5 U， phi29聚合酶 8 U， Hemin 2.5 mM， Exo III反应时间30分钟，RCA反应时间2.5小时，孵育温度37°C， pH 7.5）。此外，还利用原子力显微镜（AFM）观察了RCA产物，证实了长链DNA纳米结构的形成（长度超过700 nm），验证了RCA过程的有效性。通过电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安法（CV）对不同修饰阶段的电极进行了表征，证实了传感界面构建的成功以及电子传递电阻的变化符合实验设计预期。
四、 主要研究结果
1. 传感机制可行性验证： DPV结果表明，在没有目标物AβO存在时，仅加入Exo III、RCA模板、聚合酶和dNTPs等扩增组分，电极仅产生微弱的背景电流。而当加入0.1 nM的AβO后，在-0.36 V处观察到一个显著增强的还原峰，这归因于大量Hemin/G-四链体复合物在电极表面的形成。AFM图像直观地展示了RCA反应后电极表面形成的长链DNA结构，为RCA的成功实施提供了直接证据。CV扫描速率实验表明，峰电流与扫描速率的平方根呈线性关系，说明该电化学过程是受扩散控制的，表明Hemin在电极表面的电子转移是可逆且有效的。
2. 检测性能： 在最优条件下，该传感器对AβO表现出优异的检测性能。DPV响应电流与AβO浓度的对数在100 fM（飞摩尔每升）到10 nM（纳摩尔每升）的宽达五个数量级的动态范围内呈现良好的线性关系。线性回归方程为lg(I) = 17.8 + 2.1 lg C，相关系数R² = 0.9965。根据信噪比（S/N=3）计算得出的检出限（Limit of Detection, LOD）低至39 fM（或换算为39 fg/mL，因文中单位存在混用，根据上下文，39 fmol L−1应为39 fM）。这一灵敏度优于文中列举的多项已报道的基于LSPR、SWV、LSV、荧光等方法的AβO检测技术（见表1），凸显了本研究所设计双级放大策略的优势。
3. 选择性与特异性： 为了评估传感器在复杂生物环境中的抗干扰能力，研究测试了多种潜在的干扰物质，包括牛血清白蛋白（BSA）、免疫球蛋白G（IgG）、L-半胱氨酸、凝血酶（Thrombin），以及Aβ的其他形态如Aβ纤维（Aβ fibrils, AβF）和Aβ单体（Aβ monomers, AβM）。实验结果显示，即使在1 nM的高浓度下，这些干扰物质产生的DPV响应信号也微乎其微；而0.1 nM的AβO则能产生强烈的信号响应。这表明该传感器所使用的适配体对AβO具有高度的特异性识别能力，传感器本身具有良好的选择性。
4. 重现性与稳定性： 使用三个独立制备的传感器对同一浓度（0.1 nM）的AβO进行检测，其响应电流的相对标准偏差（RSD）为4.73%，表明传感器制备方法具有可接受的重现性。将传感器在4°C的Tris-HCl缓冲液中储存两周后，其DPV响应信号仍能保持初始值的92%以上，显示出良好的长期稳定性。
5. 实际样品分析： 为了验证传感器的实际应用潜力，研究团队将其应用于临床血清样本和人工脑脊液（Artificial Cerespinal Fluid, ACSF）样本中AβO的检测。对来自健康人和AD患者的五份临床血清样本进行检测，所得结果与标准ELISA方法的检测结果基本一致（见表2），证明了该传感器在真实生物样本中检测的可靠性。此外，在ACSF样本中进行加标回收实验，添加三个不同浓度（1 nM, 10 pM, 1 pM）的AβO标准品，测得的回收率在97%到104.5%之间，RSD小于5.4%（见表3）。这些结果充分证明了该传感器在实际复杂样本基质中检测AβO的准确性和可行性。
五、 研究结论与价值
本研究成功构建了一种基于Exo III辅助DNA循环扩增和RCA诱导Hemin/G-四链体形成的双级放大、免标记、“信号开启”型电化学适配体传感器，用于超灵敏检测阿尔茨海默病的关键生物标志物Aβ寡聚体。该传感器具有以下重要价值：
科学价值： 提出并验证了一种将目标物识别、酶辅助循环扩增、等温核酸扩增（RCA）以及G-四链体/Hemin信号报告系统巧妙整合的一体化传感新策略。该策略通过两级级联放大，将单个目标物结合事件转化为大量电活性信号分子（Hemin）在电极表面的富集，极大地提高了检测灵敏度，为超痕量生物分子的检测提供了新的思路和通用平台。
应用价值： 所开发的传感器对AβO的检测限低至39 fM，动态范围宽，且具有良好的选择性、重现性和稳定性。更重要的是，它在临床血清样本和模拟生物体液中表现出了可靠的检测能力。这使其在AD的早期筛查、疾病进展监测以及相关药物疗效评估等方面具有巨大的临床应用前景。由于整个检测过程无需对核酸或目标物进行复杂的标记，简化了操作步骤，降低了成本，更有利于向实用化、便携式诊断设备方向发展。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
本研究还对传感器构建过程中的关键参数进行了详尽的优化，为后续研究者重现和改进该方法提供了详细参考。此外，文中通过电化学阻抗谱（EIS）、循环伏安（CV）、原子力显微镜（AFM）等多种表征手段，从不同角度验证了传感界面构建的成功和各步反应的顺利进行，体现了研究的系统性和严谨性。作者团队也明确声明无利益冲突，并感谢了中国国家自然科学基金、广西自然科学基金等项目的资助，符合规范的学术发表要求。