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CAR-T细胞库筛选揭示下一代免疫疗法的多样化免疫信号域
作者及机构
本研究由Daniel B. Goodman（加州大学旧金山分校微生物与免疫学系）、Camillia S. Azimi（帕克癌症免疫治疗研究所）等20余位作者合作完成，通讯作者为Kole T. Roybal（加州大学旧金山分校细胞设计研究所）。论文于2022年11月9日发表于*Science Translational Medicine*（期刊号：14(670), eabm1463），并获美国国立卫生研究院（NIH）等机构资助。
学术背景
研究领域与动机
嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cells, CAR-T）疗法在B细胞白血病和淋巴瘤中取得突破，但针对实体瘤和复发性恶性肿瘤的疗效有限，主要因CAR-T细胞持久性不足和长期抗原刺激导致的耗竭。目前临床使用的CAR-T细胞仅依赖两种共刺激域（4-1BB或CD28），而其他免疫细胞（如B细胞、NK细胞）的信号域尚未系统探索。
科学问题
本研究提出“CAR库筛选（CAR pooling）”技术，通过高通量方法从40种免疫信号域中筛选能增强CAR-T细胞持久性和细胞毒性的新型共刺激域，尤其关注肿瘤坏死因子受体（TNF receptor, TNFR）家族成员。
研究流程与方法
1. CAR库构建与初筛
- 文库设计：合成40种来自不同免疫细胞（T细胞、B细胞、NK细胞等）的细胞内信号域，克隆至第二代CAR骨架（含CD3ζ和GFP报告基因），构建慢病毒文库。
- 细胞模型：从健康供体外周血单核细胞（PBMC）中分选CD4+和CD8+ T细胞，分别转导CAR文库，通过流式分选控制CAR表达水平。
- 重复刺激模型：模拟长期肿瘤抗原暴露，每3天用辐照的CD19+ K562细胞刺激CAR-T细胞，持续24-33天，通过流式测序（FlowSeq）量化细胞增殖（CellTrace Violet稀释）、活化（CD69）、细胞因子（IFN-γ、IL-2）等指标。
2. 多维表型分析
- 功能聚类：通过主成分分析（PCA）和层次聚类，将信号域分为促增殖型（如CD40）、细胞毒性型（如BAFF-R、TACI）和抑制型（如KLRG1）。
- 单细胞转录组与表面蛋白组：采用10x Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq）和CITE-seq（75种表面蛋白抗体），分析CAR-T细胞在静息和激活状态下的代谢（糖酵解vs氧化磷酸化）和分化特征。
3. 体内验证
- 间皮瘤模型（M28）：NSG小鼠皮下接种CD19+ M28细胞后，注射不同CAR-T细胞（含TCR敲除），评估肿瘤清除率。
- 多发性骨髓瘤模型（MM1S）：比较临床标准（4-1BB）与BAFF-R信号域的BCMA靶向CAR-T细胞在低剂量下的抗肿瘤效果。
创新方法
- CAR pooling技术：首次将高通量文库筛选应用于CAR信号域优化，实现并行比较40种信号域。
- scENITH代谢分析：通过寡霉素抑制线粒体氧化磷酸化，量化不同CAR-T细胞的代谢偏好性。
主要结果
1. TNF受体家族信号域的优势
- BAFF-R与TACI：显著增强长期细胞毒性（体外杀伤效率比CD28高1.5倍），且延迟耗竭标志物（PD-1、TIM-3）表达。单细胞分析显示其富集于“细胞毒性簇”，高表达颗粒酶（GZMB）、穿孔素（PRF1）和CD29整合素（与临床疗效正相关）。
- CD40：在CD4+ T细胞中促增殖能力最强（累积扩增比4-1BB高1.8倍），但体内抗肿瘤效果较弱，提示增殖与杀伤功能的权衡。
2. 抑制性信号域KLRG1
- 显著抑制CAR-T细胞活化（CD69表达降低70%），维持初始态表型（CD62L+），为调控CAR活性提供新工具。
3. 体内疗效验证
- BAFF-R CAR-T：在MM1S模型中，低剂量即可显著延长小鼠生存期（p<0.05），肿瘤清除率优于4-1BB CAR-T。
结论与意义
科学价值
1. 扩展CAR信号域工具箱：发现BAFF-R、TACI等非经典T细胞信号域可增强CAR-T持久性和 cytotoxicity（细胞毒性），为实体瘤治疗提供新靶点。
2. 单细胞机制解析：揭示“细胞毒性簇”转录特征（如CD29+、IFN-γ+）与临床疗效的关联，为疗效预测提供标志物。
应用前景
- BAFF-R CAR-T有望改善多发性骨髓瘤的复发难题；
- KLRG1可用于设计“可调控CAR”，减少细胞因子释放综合征（CRS）风险。
研究亮点
- 方法创新：首创“CAR pooling”高通量筛选平台，兼容体外与体内验证。
- 跨谱系信号域挖掘：突破T细胞限制，发现B细胞信号域（BAFF-R）的跨界应用。
- 多维数据整合：结合FlowSeq、scRNA-seq和代谢分析，全面解析信号域-表型关系。
局限性
- 文库未覆盖所有免疫受体家族；
- NSG小鼠模型未能完全模拟人体肿瘤微环境。
此研究为下一代CAR-T设计提供了系统性框架，相关专利（#048697）已进入转化阶段。