针对胰腺癌的CAR-T细胞序贯疗法新策略：靶向FAP重塑肿瘤微环境以增强CLDN18.2靶向疗效
一、 研究团队与发表信息
本研究由刘逸凡、孙艳莎、王鹏、李松岭、董祎玮、周敏、施碧志、姜华、孙瑞新*和李宗海*共同完成。研究团队主要来自上海交通大学医学院附属仁济医院上海市肿瘤研究所癌基因及相关基因国家重点实验室、上海交通大学医学院生物医学工程学院仁济- Med X临床干细胞研究中心以及科济生物医药（上海）有限公司。该研究成果以题为“FAP‑targeted CAR‑T suppresses MDSCs recruitment to improve the antitumor efficacy of claudin18.2‑targeted CAR‑T against pancreatic cancer”的论文形式，于2023年发表在期刊 Journal of Translational Medicine 上。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于肿瘤免疫治疗领域，具体聚焦于嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T-cell， CAR-T）疗法在实体瘤中的应用。胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma， PDAC）是一种恶性程度高、预后极差的肿瘤，其5年生存率仅约10%。CAR-T疗法在血液肿瘤中取得了革命性成功，但在PDAC等实体瘤中疗效有限，主要障碍之一是免疫抑制性的肿瘤微环境（Tumor Microenvironment， TME）。PDAC的TME以富含癌症相关成纤维细胞（Cancer-Associated Fibroblasts， CAFs）为特征，这些细胞通过形成物理屏障和分泌免疫抑制因子，阻碍T细胞浸润和功能。
研究团队前期开发了靶向紧密连接蛋白Claudin 18.2（CLDN18.2）的CAR-T细胞，该抗原在胃癌和胰腺癌中高表达。初步临床试验（NCT03874897）显示其在晚期胃肠道癌症中具有安全性和一定抗肿瘤活性。然而，在胰腺癌模型中，CLDN18.2靶向CAR-T细胞的肿瘤内积累有限，疗效有待提升。成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein， FAP）是活化CAFs的关键标志物。先前研究提示，靶向FAP可能是一种重塑TME的策略，但FAP靶向CAR-T的研究结果存在矛盾，且单独使用疗效有限。
因此，本研究旨在探究一种序贯治疗策略：首先使用FAP靶向CAR-T细胞清除TME中的CAFs，重塑免疫抑制环境；随后再输注CLDN18.2靶向CAR-T细胞攻击肿瘤细胞。研究的目标是验证这种策略能否克服CAFs构成的屏障，抑制髓源性抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells， MDSCs）的募集，从而显著增强CLDN18.2靶向CAR-T疗法在胰腺癌中的抗肿瘤效果。
三、 详细研究流程与方法
本研究是一个综合性实验研究，结合了生物信息学分析、体外细胞实验和体内动物模型验证，流程严谨且环环相扣。
1. 生物信息学分析（数据来源与处理）： 研究首先从癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas， TCGA）数据库获取了19种常见实体瘤的基因表达数据。利用R语言及相关软件包（如“limma”、“maxstat”），研究者分析了FAP在胰腺癌等多种癌症中的表达情况。通过最大化选择统计量确定了区分PDAC患者预后的最佳FAP表达截断值，将患者分为高FAP组和低FAP组。随后，使用ESTIMATE算法评估肿瘤纯度，并利用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis， GSEA）和单样本GSEA（ssGSEA）探究了高FAP表达与上皮-间质转化（EMT）、免疫抑制特征（如MDSCs、调节性T细胞）及相关信号通路（如IL-6/STAT3， TGF-β）的关联。此外，还从人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas， HPA）数据库获取了胰腺癌组织的FAP蛋白免疫组化染色结果进行验证。
2. 新型CAR-T细胞的构建与体外功能验证： * 抗体与CAR结构设计： 研究团队通过噬菌体展示技术筛选出一种全新的全人源抗FAP单链可变区片段（scFv），命名为8E3。通过表面等离子共振（Biacore）技术验证了该抗体对人和小鼠FAP的高亲和力。基于此scFv，构建了第二代小鼠FAP靶向CAR（8E3-mBBz），其结构包含抗FAP scFv、小鼠CD8α铰链区和跨膜区、以及小鼠4-1BB和CD3ζ胞内信号域。同时，使用了团队之前开发的靶向CLDN18.2的CAR（8E5-mBBz）作为对照。 * CAR-T细胞制备： 通过逆转录病毒转导小鼠脾脏来源的T细胞，成功制备了FAP-mBBz CAR-T和CLDN18.2-mBBz CAR-T细胞，流式细胞术检测其转导效率分别为41%和62%。 * 靶细胞系构建： 通过慢病毒转导，使小鼠胰腺癌细胞系Panc02稳定表达小鼠CLDN18.2（命名为Panc02-A2）；使小鼠成纤维细胞系NIH 3T3稳定表达小鼠FAP（命名为3T3-mFAP）。 * 体外细胞毒性实验： 采用乳酸脱氢酶（LDH）释放法，在96孔板中将CAR-T细胞与靶细胞按不同效靶比共培养18小时。结果显示，CLDN18.2-mBBz CAR-T细胞能特异性裂解表达CLDN18.2的Panc02-A2和KPC1199细胞；而FAP-mBBz CAR-T细胞能高效裂解表达mFAP的3T3细胞，但对不表达FAP的3T3细胞无杀伤作用，证明了CAR-T细胞的特异性。
3. 体内动物实验： 研究使用了两种免疫健全的C57BL/6小鼠胰腺癌模型：皮下接种Panc02-A2细胞和KPC1199细胞（一种源自KPC转基因小鼠的PDAC细胞系）。 * CAFs对CAR-T疗效影响的验证模型： 为了直接证明CAFs的抑制作用，研究者建立了一个乳腺癌模型（E0771-EGFRvIII细胞），并将其与不同数量的NIH 3T3成纤维细胞混合后接种。然后给予靶向EGFRvIII的CAR-T细胞治疗，通过测量肿瘤体积、重量以及肿瘤组织内CAR拷贝数，评估CAFs对CAR-T细胞浸润和疗效的影响。 * 序贯治疗核心实验： * 治疗设计： 在胰腺癌模型肿瘤建立后，小鼠被分为四组：(1) 序贯治疗组（FAP + CLDN18.2）：先输注FAP-mBBz CAR-T细胞，7天后输注CLDN18.2-mBBz CAR-T细胞；(2) FAP重复治疗组（FAP + FAP）；(3) CLDN18.2重复治疗组（CLDN18.2 + CLDN18.2）；(4) 空白T细胞对照组（UTD + UTD）。所有治疗前24小时均腹腔注射环磷酰胺（CPA）进行淋巴细胞清除。 * 疗效评估： 定期测量肿瘤体积和体重，计算肿瘤抑制率，并在实验终点比较肿瘤重量。 * 机制探究样本采集： 在治疗过程中的特定时间点（如首次输注后第7天），处死小鼠，采集肿瘤组织进行后续分析。
4. 机制研究的实验方法： * 肿瘤浸润免疫细胞分析： 将肿瘤组织消化成单细胞悬液，通过多色流式细胞术检测肿瘤内CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、MDSCs（CD11b+ Ly6G+ Ly6C+）、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞的比例，以及T细胞衰竭标志物（PD-1， TIM-3， LAG-3）和肿瘤细胞PD-L1的表达。 * 组织学与分子分析： * 免疫组织化学（IHC）： 对肿瘤组织切片进行染色，检测α-SMA（标记CAFs）、CD4和CD8，量化CAFs面积和T细胞浸润数量。 * 实时定量PCR（RT-qPCR）： 提取肿瘤组织基因组DNA，通过TaqMan探针法定量CAR拷贝数，反映CAR-T细胞在肿瘤内的存留情况。同时检测CAFs分泌的关键趋化因子CXCL12的mRNA水平。 * 小动物PET成像： 使用FAP抑制剂（FAPI）探针进行PET-CT成像，直观显示肿瘤部位FAP阳性CAFs的代谢活性，评估FAP靶向CAR-T细胞对CAFs的清除效果。
5. 数据分析与统计： 所有体外和体内实验数据均以均值±标准误表示。两组间比较采用Student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），肿瘤生长曲线采用双因素ANOVA分析。使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析，P值<0.05被认为具有统计学显著性。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
1. 生物信息学分析结果： FAP在胰腺癌和乳腺癌中表达显著上调。高FAP表达的PDAC患者肿瘤纯度更低（基质更丰富），总生存期更差，且其基因特征与免疫抑制（高MDSCs、Treg特征）、EMT、IL-6/STAT3和TGF-β信号通路激活以及趋化因子释放显著相关。HPA数据库的IHC结果证实，多数胰腺癌样本中存在大量FAP中度或高度染色的CAFs。这为靶向FAP提供了理论依据和临床相关性。
2. CAFs损害CAR-T疗效的验证结果： 在E0771乳腺癌模型中，混合NIH 3T3成纤维细胞后，EGFRvIII靶向CAR-T细胞的抗肿瘤效果显著降低，肿瘤内CAR-T细胞拷贝数也减少。这直接证明了CAFs是CAR-T疗法在实体瘤中的障碍，为后续靶向清除CAFs的策略提供了必要性证明。
3. 新型CAR-T细胞的体外功能结果： 成功构建了能特异性结合人和鼠FAP的高亲和力抗体8E3，并基于此开发了FAP-mBBz CAR-T细胞。体外实验证实，该CAR-T细胞能高效、特异性地杀伤表达FAP的成纤维细胞，而对非表达细胞无作用。CLDN18.2-mBBz CAR-T细胞也显示出对相应抗原阳性肿瘤细胞的特异性杀伤。
4. 序贯治疗的体内抗肿瘤效果： 在Panc02和KPC1199两种胰腺癌小鼠模型中，序贯治疗组（FAP后接CLDN18.2 CAR-T）显示出最强的抗肿瘤效果，其肿瘤体积和重量显著小于单用CLDN18.2 CAR-T重复治疗组或FAP CAR-T重复治疗组。在整个治疗过程中，各组小鼠体重无显著差异，重要器官的H&E染色未发现明显病理损伤，初步证明了该策略的安全性和耐受性。此结果直接回答了核心科学问题：序贯治疗能显著提升疗效。
5. 序贯治疗增强T细胞浸润与存活： IHC和流式细胞术分析显示，序贯治疗组肿瘤组织中CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的浸润数量显著多于其他组。更重要的是，通过qPCR检测肿瘤组织中的CAR拷贝数发现，序贯治疗组中CAR-T细胞的存留量也显著高于CLDN18.2 CAR-T重复治疗组。这表明FAP CAR-T的预处理为后续CLDN18.2 CAR-T的浸润和存活创造了更有利的条件。
6. FAP靶向CAR-T清除CAFs并改变TME： * 清除CAFs： IHC显示，输注FAP-mBBz CAR-T细胞7天后，肿瘤组织内α-SMA阳性的CAFs面积大幅减少，而CLDN18.2-mBBz组则无此效果。PET-CT成像显示，FAP CAR-T治疗组肿瘤部位的FAPI信号（代表FAP活性）显著降低。同时，CAFs分泌的关键趋化因子CXCL12的mRNA水平也显著下降。这三项证据强有力地证实了FAP CAR-T能有效清除肿瘤内的CAFs。 * 抑制MDSCs募集： 流式细胞术分析发现，FAP CAR-T治疗组肿瘤内MDSCs的比例显著低于CLDN18.2 CAR-T治疗组和对照组。这与生物信息学分析中高FAP与MDSCs特征相关的发现一致。机制上，CAFs被清除导致其分泌的CXCL12等趋化因子减少，可能是MDSCs募集受阻的原因。 * 对其它免疫细胞的影响： FAP CAR-T治疗增加了肿瘤内CD45+总免疫细胞和CD8+ T细胞的浸润，但对巨噬细胞、树突状细胞、NK细胞的比例以及T细胞衰竭标志物、PD-L1表达未见显著影响。
结果逻辑链： 生物信息学提示FAP高表达与免疫抑制相关 → 实验证实CAFs损害CAR-T功能 → 成功构建能清除CAFs的FAP CAR-T → 序贯治疗在体内显示出优越疗效 → 机制研究发现，FAP CAR-T通过清除CAFs，降低了CXCL12等因子，从而抑制了MDSCs的肿瘤内募集 → MDSCs的减少缓解了免疫抑制，使得后续输注的CLDN18.2 CAR-T细胞以及内源性CD8+ T细胞能够更好地浸润并在肿瘤内存活和发挥作用 → 最终实现更强的抗肿瘤效果。
五、 研究结论与价值
本研究得出结论：在免疫健全的胰腺癌小鼠模型中，先输注FAP靶向CAR-T细胞，再输注CLDN18.2靶向CAR-T细胞的序贯治疗策略，能通过重塑肿瘤微环境，显著增强抗肿瘤疗效。其核心机制在于，FAP CAR-T细胞能有效清除肿瘤基质中的CAFs，进而抑制CAFs介导的MDSCs募集，从而改善肿瘤免疫抑制环境，促进后续CLDN18.2 CAR-T细胞及内源性细胞毒性T细胞的浸润和存活。
科学价值： 1. 提出了实体瘤CAR-T治疗的新策略： 将CAR-T细胞的功能从直接杀伤肿瘤细胞，拓展到“改造肿瘤微环境”，为克服实体瘤治疗障碍提供了新思路。 2. 阐明了关键机制： 不仅验证了FAP CAR-T清除CAFs的效果，更深入揭示了其下游效应——通过减少CXCL12等因子抑制MDSCs募集，这为理解CAFs与免疫抑制细胞网络的相互作用提供了新的实验证据。 3. 验证了序贯给药的合理性： 基于CAR-T细胞动态变化（输注后约7天达到浸润高峰）设计治疗间隔，并避免了混合输注可能带来的免疫原性问题，为临床方案设计提供了参考。
应用价值： 1. 为胰腺癌治疗提供了有前景的联合疗法： CLDN18.2靶向CAR-T已进入临床试验，本研究为其疗效提升提供了一个可行的联合方案。 2. 推动了FAP作为CAR-T靶点的研发： 本研究开发的新型全人源抗FAP CAR-T在模型中显示出良好的安全性和清除CAFs的有效性，有助于澄清此前关于该靶点安全性的争议，并支持其作为“微环境调节剂”而非主要杀伤剂的开发定位。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究也讨论了该策略的局限性及未来方向，例如：未使用原位肿瘤模型可能无法完全模拟胰腺癌的复杂微环境；未来需要探索双靶点CAR-T或混合CAR-T与序贯治疗的优劣；需要进一步优化序贯治疗的剂量组合和时间间隔，可能借助实时成像技术监测CAFs和CAR-T细胞的动态变化。这些讨论为后续研究指明了方向。
此外，研究在讨论部分提出了一个有趣的“旁观者效应”可能性：FAP CAR-T细胞可能通过分泌IFN-γ等细胞因子，对邻近的CLDN18.2阳性肿瘤细胞产生间接杀伤作用，这或许能解释其在治疗初期观察到的短暂直接抗肿瘤效果。这为CAR-T的作用机制提供了更丰富的视角。