自动化N-糖基化测序技术在生物制药中的应用：毛细管电泳方法的突破

作者与发表信息
本研究由Marton Szigeti（匈牙利德布勒森大学Horváth Csaba纪念生物分析研究所、潘诺尼亚大学）和Andras Guttman（德布勒森大学、美国SCIEX公司）合作完成，发表于2017年《Scientific Reports》期刊（DOI:10.1038/s41598-017-11493-6）。

学术背景
糖蛋白的N-连接糖基化（N-linked glycosylation）分析是生物制药和生物医学领域的关键课题。糖基化修饰的多样性直接影响蛋白质药物的生物活性、理化性质和效应功能，例如单克隆抗体（mAbs）的Fc区糖基化结构与其疗效密切相关。然而，传统糖链测序方法依赖耗时的手工操作（如外切糖苷酶（exoglycosidase）分步消化结合色谱分析），通常需数天完成。本研究旨在开发一种基于毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）的自动化糖链测序技术，显著提升分析效率。

研究流程与方法
1. 样本制备
- 研究对象：人免疫球蛋白G（IgG）和融合蛋白恩利（Enbrel, etanercept）的N-糖链。
- 糖链释放与标记：使用肽N-糖苷酶F（PNGase F）酶解释放糖链，以氨基芘三磺酸（APTS）荧光标记，并通过磁珠纯化去除游离染料。

1. 自动化测序设计

   • 半自动化方法：
     
     • 在CE仪器的温控样品室（40–60°C）中并行三组反应，分别加入唾液酸酶（sialidase）、唾液酸酶+β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、唾液酸酶+β-半乳糖苷酶+β-N-乙酰己糖胺酶（β-N-acetyl-hexosaminidase）。
       
     • 每组反应间隔12–48分钟，通过CE-LIF（激光诱导荧光检测）实时监测糖链迁移时间变化，总耗时60分钟。
       
   • 全自动化方法：
     
     • 利用CE毛细管反向压力注入酶（1.0 µL），依次递送三种外切糖苷酶至单一反应体系。
       
     • 温度梯度控制（40°C升至60°C），总耗时128分钟。
       

2. 关键技术

   • 温控反应室：CE样品仓作为恒温反应器，避免传统毛细管内反应对分离条件的限制。
     
   • 毛细管双重功能：既用于CE分离，又作为酶递送通道。
     
   • 葡萄糖单位（GU）计算：通过共注射标准品（DP2/DP15）校准迁移时间，结合数据库（GlycoBase）鉴定糖链结构。
     

3. 数据分析

   • 通过外切糖苷酶逐步消化后糖链的迁移时间偏移（ΔGU），推断糖残基类型与连接方式（如α2-3/6唾液酸、β1-4半乳糖）。
     

主要结果
1. 温度优化：β-半乳糖苷酶在50°C下45分钟可完全消化IgG糖链的Gal残基（图1），较传统37°C过夜反应效率提升10倍。
2. 半自动化测序：IgG糖链的唾液酸化（sialylation）、半乳糖基化（galactosylation）和GlcNAc切除步骤分别耗时12、36、48分钟，成功解析FA2G2S2等复杂结构（图2，表1）。
3. 全自动化测序：Enbrel糖链在128分钟内完成三步酶解，30°C分离温度下获得高分辨率谱图（图3）。
4. 核心岩藻糖（core fucosylation）：通过GU值差异直接区分核心岩藻糖化与非岩藻糖化结构，无需额外酶解。

结论与价值
1. 科学意义：首次实现CE平台的全自动化糖链测序，解决了传统方法耗时、低通量的瓶颈。
2. 应用价值：
- 为生物制药（如单抗、融合蛋白）的糖基化质控提供快速（<2.5小时）、高重现性的分析方案。
- 温控反应与毛细管酶递送技术可拓展至其他液相分离系统（如HPLC）。

研究亮点
1. 方法创新：
- 利用CE仪器固有功能（温控仓、毛细管）实现“一机多能”，无需额外设备。
- 首次实现外切糖苷酶的毛细管压力驱动递送。
2. 效率突破：较传统方法（数天）缩短至60–128分钟，且支持实时监测反应进程。
3. 结构解析能力：通过GU值数据库比对，精准识别糖链分支与连接异构体（如α2-3 vs. α2-6唾液酸）。

其他发现
- 温度敏感性：β-半乳糖苷酶在40°C下对FA2(6)G1消化不完全（图1），提示温度优化对酶活性的关键影响。
- 技术普适性：该方法适用于其他糖蛋白（如血清蛋白）分析，但需验证酶解条件适配性。

本研究为糖基化分析领域提供了里程碑式的自动化解决方案，其技术思路可能推动相关仪器设计的革新。