本文档是发表在Journal of Clinical and Translational Hepatology 2021年第9卷第3期，一篇题为“PD-1 Involvement in Peripheral Blood CD8+ T Lymphocyte Dysfunction in Patients with Acute-on-Chronic Liver Failure”的原创性研究论文。以下是对这项研究的详细介绍。

本研究由来自山西医科大学及其附属医院的科研团队完成。第一作者为Zhou Xiaoshuang，通讯作者为Yao Jia、Zhao Ninghui和He Jiefeng。作者单位包括山西省人民医院肾内科、山西白求恩医院消化内科与肝胆外科，以及山西医科大学肝病与器官移植研究所。该研究于2020年11月投稿，2021年3月修订并接受，最终于2021年3月31日正式发表。

学术背景与研究目的 本研究聚焦于乙型肝炎病毒相关的慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）的免疫学机制领域。HBV-ACLF是一种病情危重、进展迅速且死亡率高的临床综合征，其病理生理过程与广泛的免疫激活、系统性炎症反应以及随后出现的免疫功能障碍密切相关。这种免疫缺陷状态导致患者极易发生继发性感染，是死亡的主要原因之一。尽管已知T淋巴细胞功能障碍是ACLF免疫抑制的重要环节，但其具体的分子机制尚不明确。

程序性死亡受体-1（PD-1， Programmed cell death-1）是表达在活化T细胞表面的重要免疫检查点分子，与其配体PD-L1/PD-L2结合后可传递抑制性信号，负向调控T细胞的活化、增殖及细胞因子分泌，在维持免疫耐受和防止免疫过激中起关键作用。近年研究表明，在癌症和慢性感染等背景下，T细胞的功能耗竭常伴随PD-1的高表达。同时，细胞代谢，特别是糖酵解，对于T细胞活化和功能至关重要。活化的效应T细胞会从氧化磷酸化转变为以糖酵解为主的代谢模式，此过程需要葡萄糖转运蛋白1（Glut1， Glucose transporter 1）及关键糖酵解酶如己糖激酶2（HK2， Hexokinase-2）和丙酮酸激酶M2型（PKM2， Pyruvate kinase）的参与。有研究提示，PD-1信号可能通过干扰T细胞的代谢重编程来抑制其功能。

基于上述背景，本研究提出了一个科学假设：在HBV-ACLF患者中，PD-1可能通过抑制CD8+ T细胞的糖酵解代谢，从而导致其功能障碍。为了验证这一假说，本研究设定了明确的研究目标：1. 比较HBV-ACLF患者与健康对照者外周血CD8+ T细胞的数量、功能、PD-1及糖酵解相关分子表达的差异；2. 在体外实验中，探讨激活PD-1/PD-L1信号通路对ACLF患者CD8+ T细胞糖酵解水平和免疫功能的影响，从而阐明PD-1在ACLF免疫抑制中的潜在作用机制。

详细研究流程 本研究设计严谨，包含临床样本分析和体外功能验证两大部分，流程清晰。

第一，研究对象招募与分组。 研究于2018年6月至2019年6月期间，从山西白求恩医院消化内科招募了30名符合亚太肝脏研究协会（APASL）诊断标准的HBV-ACLF患者作为病例组。同时，同期招募了30名肝功能正常、乙肝表面抗原阴性的健康志愿者作为健康对照组（HCs）。所有研究对象均排除了酒精性、药物性或其他病毒性肝炎、肿瘤以及其他免疫系统疾病。研究方案获得了医院伦理委员会的批准，所有参与者均签署了知情同意书。

第二，临床样本分析。 1. CD8+ T细胞计数与分选： 研究者首先使用流式细胞术检测了患者与健康对照者外周血中CD8+ T细胞的绝对数量。随后，采用免疫磁珠分选技术从外周血单核细胞中高纯度（>99%）地分离出CD8+ T细胞，用于后续的表型和功能分析。 2. PD-1与Glut1表达检测： 将分选得到的CD8+ T细胞用荧光标记的抗PD-1和抗Glut1抗体进行染色，通过流式细胞术检测这两种分子在细胞表面的表达水平，以百分比或平均荧光强度表示。 3. 糖酵解能力初步评估： 使用放射性标记的葡萄糖类似物（2-脱氧-D-[3H]-葡萄糖）摄取实验，直接测量了从HBV-ACLF患者和健康对照者分离的CD8+ T细胞的葡萄糖摄取能力。此外，通过蛋白质印迹法检测了细胞中关键糖酵解酶HK2和PKM2的蛋白表达水平。

第三，体外细胞培养与干预实验。 为了直接探究PD-1信号的作用，研究团队建立了体外细胞培养模型，分为三组： * HC组： 来自健康对照者的CD8+ T细胞，使用抗CD3/CD28抗体刺激活化。 * ACLF组： 来自HBV-ACLF患者的CD8+ T细胞，使用抗CD3/CD28抗体刺激活化，并加入IgG作为同型对照。 * ACLF+PD-1组： 来自HBV-ACLF患者的CD8+ T细胞，使用抗CD3/CD28抗体刺激活化，并加入PD-L1-IgG融合蛋白以特异性激活PD-1/PD-L1信号通路。 所有细胞在培养48小时后，收集进行各项检测。

第四，免疫功能与糖酵解代谢的全面评估。 在体外培养后，对三组细胞进行了以下平行检测： 1. 免疫功能指标： * 增殖能力： 通过流式细胞术检测细胞增殖标志物Ki67的表达。 * 活化状态： 通过流式细胞术检测早期活化标志物CD69的表达。 * 细胞因子分泌： 在蛋白质转运抑制剂存在下，用佛波酯和离子霉素刺激细胞，然后通过流式细胞术胞内染色检测白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的产生水平。 2. 糖酵解代谢指标： * 葡萄糖摄取： 再次使用放射性葡萄糖摄取实验评估干预后的细胞代谢活性。 * 糖酵解相关蛋白表达： 通过蛋白质印迹法检测Glut1、HK2和PKM2的蛋白表达变化。

第五，数据分析。 所有数据使用SPSS 19.0软件进行统计分析。符合正态分布的连续数据以均值±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验或卡方检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。

主要研究结果 研究获得了一系列层次分明、相互印证的结果，有力地支持了其核心假设。

首先，在临床样本层面，HBV-ACLF患者的CD8+ T细胞呈现数量减少、功能抑制和代谢改变的表型。 具体数据如下： * 患者外周血CD8+ T细胞的绝对数量显著低于健康对照（333.88 ± 147.74 vs. 872.50 ± 206.64， p<0.001）。 * 患者CD8+ T细胞表面的PD-1表达比例显著高于健康对照（13.33% ± 2.52% vs. 7.02% ± 2.12%， p=0.021），而Glut1的表达比例则显著降低（13.33% ± 1.40% vs. 19.27% ± 2.05%， p=0.016）。 * 在功能上，患者的CD8+ T细胞处于“免疫麻痹”状态：其活化标志物CD69、增殖标志物Ki67的表达均显著低于健康对照；同时，关键效应细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的分泌水平也全面下降（所有p<0.001）。 * 在代谢层面，从患者分离的CD8+ T细胞的葡萄糖摄取能力明显减弱（2.8 ± 0.11 vs. 3.6 ± 0.14 pmol/细胞， p=0.017），且HK2和PKM2的蛋白表达水平也显著降低（p<0.001）。

这些结果首次在HBV-ACLF患者中系统描绘了CD8+ T细胞功能障碍与糖酵解代谢受损并存的局面，并且将这种异常状态与PD-1的高表达关联起来，为后续的机制探索提供了直接的临床证据和出发点。

其次，体外干预实验直接证明了PD-1信号通路是导致CD8+ T细胞糖酵解抑制和功能缺陷的关键环节。 这是本研究的核心机制验证部分，结果逻辑严谨： * 对糖酵解的影响： 与未激活PD-1信号的ACLF组相比，使用PD-L1-IgG激活PD-1信号的ACLF+PD-1组，其CD8+ T细胞的葡萄糖摄取能力进一步下降（2.0 ± 0.21 vs. 2.8 ± 0.11 pmol/细胞， p<0.001）。更重要的是，糖酵解途径的关键分子Glut1、HK2和PKM2的蛋白表达水平也呈现一致的显著下降趋势（所有p<0.001）。这直接证明，在ACLF背景下，PD-1信号的激活能够特异性地下调CD8+ T细胞的糖酵解代谢程序。 * 对免疫功能的影响： 与糖酵解抑制相呼应，PD-1信号的激活也加剧了CD8+ T细胞的功能障碍。ACLF+PD-1组细胞的增殖能力（Ki67）、活化状态（CD69）比ACLF组更弱。尤为关键的是，其分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的能力也受到进一步的显著抑制（所有p<0.05）。这建立了“PD-1激活 → 糖酵解抑制 → 免疫功能下降”的因果链条。

研究结论与价值 本研究得出明确结论：在HBV-ACLF患者中，外周血CD8+ T细胞存在显著的功能障碍，表现为数量减少、活化增殖能力减弱及细胞因子分泌减少。这种功能障碍与PD-1表达上调密切相关。机制上，PD-1很可能通过抑制CD8+ T细胞的糖酵解代谢途径（表现为下调Glut1、HK2、PKM2表达及葡萄糖摄取）来介导其免疫抑制功能。

本研究的科学价值在于，它从一个新的角度——免疫代谢调控——揭示了ACLF免疫抑制的潜在机制。将经典的免疫检查点PD-1与T细胞能量代谢联系起来，为理解ACLF等危重疾病中复杂的免疫紊乱提供了新的理论框架。其应用价值则在于，研究结果提示靶向PD-1/PD-L1轴可能成为恢复ACLF患者免疫功能、降低继发感染风险的一种潜在治疗策略。作者在讨论部分也谨慎地提出了这一可能性，为未来的转化研究和临床试验提供了重要的理论依据。

研究亮点 1. 研究视角新颖： 首次在HBV-ACLF这一特定临床背景下，系统探究了PD-1对CD8+ T细胞糖酵解代谢和功能的调控作用，将免疫检查点与细胞代谢两大热点领域有机结合。 2. 实验设计严谨： 采用了“临床现象观察 → 体外机制验证”的经典研究范式。不仅描述了患者与健康人的差异，还通过设立ACLF组和ACLF+PD-1组的精细体外对照，直接证明了PD-1信号的因果作用，使结论更具说服力。 3. 检测指标全面： 研究综合运用了流式细胞术、放射性同位素摄取、蛋白质印迹等多种技术，从细胞数量、表面标记、细胞因子分泌到代谢酶表达和底物摄取，多维度、多层次地评估了CD8+ T细胞的状态，构建了完整的证据链。 4. 临床意义明确： 研究紧扣ACLF临床实践中继发感染这一棘手问题，其发现为开发新的免疫干预手段（如PD-1抑制剂）提供了直接的理论支持，具有明确的转化医学潜力。

其他有价值的内容 研究者在讨论部分还指出了本研究的局限性及未来方向，体现了科学的严谨性。例如，他们提到本研究仅初步揭示了PD-1与糖酵解的相关性，未来需要更深入的分子研究来阐明具体的调控基因和蛋白。此外，他们也提出，ACLF中CD8+ T细胞的功能障碍可能不仅涉及PD-1，其他抑制性受体（如淋巴细胞活化基因-3, LAG-3）也可能参与，且代谢异常是否导致细胞凋亡增加等问题也值得进一步探索。这些思考为后续研究指明了方向。

这项由Zhou Xiaoshuang等人完成的研究，是一项设计良好、执行扎实、结论重要的原创性工作，为深入理解HBV-ACLF的免疫病理机制和探索新的治疗靶点做出了有价值的贡献。