关于结直肠癌肿瘤微环境患者分层及免疫逃逸机制的单细胞整合分析研究报告
本研究由来自中国昌平实验室（Changping Laboratory）的褚晓晶、李相杰、张宇、党国辉、苗雨慧、徐文斌、王金玉，以及来自北京大学（Peking University）的张泽民与程思进共同完成。该研究于2024年8月15日在线发表于学术期刊《自然·癌症》（*Nature Cancer*）2024年9月刊的第5卷。
一、 研究背景与目标
结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球最常见的恶性肿瘤之一。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）在结直肠癌的进展、治疗反应和临床结局中扮演着至关重要的角色。尽管已有大量研究描绘了结直肠癌的分子图谱并建立了共识分子亚型（Consensus Molecular Subtypes, CMSs），但对于结直肠癌TME在个体间的异质性（interindividual heterogeneities）仍缺乏深入理解。既往的单细胞研究受限于样本量和细胞数量，难以全面、深入地刻画结直肠癌TME的细胞异质性。同时，不同研究采用各自的细胞注释流程，使得跨研究比较和通用细胞亚群定义的建立变得困难。因此，建立一个统一、高质量的人类结直肠癌单细胞参考图谱，并在此基础上探究患者间TME异质性及其临床意义，对于理解结直肠癌的发病机制和开发个性化免疫疗法至关重要。
本研究旨在通过整合大规模的人类结直肠单细胞转录组数据，构建一个全面的结直肠组织单细胞图谱，系统比较肿瘤组织与癌旁及非癌组织在转录层面的重塑，识别肿瘤特异性细胞亚群，并基于TME的细胞组成异质性对患者进行分层，以揭示不同患者亚群中癌细胞可能采用的不同的免疫逃逸机制。此外，研究还试图通过关联单细胞转录谱与全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）鉴定的风险基因，探索结直肠癌遗传易感性的主要效应细胞类型。
二、 详细研究流程
本研究是一个基于公共数据集的综合性生物信息学分析，其核心流程包括数据整合与图谱构建、细胞异质性表征、患者分层、机制探索以及遗传风险关联分析等多个步骤。
1. 数据收集与单细胞图谱构建： 研究者从15个已发表的公共数据集中，系统性地收集了来自192名供体、共计427个样本的单细胞RNA测序数据。这些样本涵盖了生理和病理状态下的结直肠组织，包括健康组织、溃疡性结肠炎患者的非炎症和炎症组织、结直肠息肉组织、结直肠癌患者的癌旁组织和肿瘤组织。原始数据总计包含超过114万个细胞。经过严格的质量控制（如过滤低质量细胞、去除潜在双联体），最终构建了一个包含671，192个高质量单细胞的结直肠参考图谱，并通过统一的分析流程（使用Seurat和Harmony软件进行数据整合、降维和聚类）将其注释为58个细胞亚群，包括15个T细胞/NK细胞/固有淋巴细胞亚群、12个髓系细胞亚群、12个内皮细胞亚群等。该图谱已公开在线访问。为了验证后续发现的稳健性，研究者还额外收集了来自31名新患者的单细胞数据作为独立验证队列。
2. 肿瘤微环境的转录重塑与细胞亚群特征分析： 利用构建的图谱，研究者首先比较了不同病理状态下主要细胞类型的比例变化。他们发现，在肿瘤组织中，IgA+浆细胞比例显著降低，而IgG+浆细胞比例升高。单核细胞/巨噬细胞在息肉和肿瘤等非生理性增殖区域富集。CD8+ T细胞在肿瘤组织中的比例高于炎症组织，凸显了其在抗肿瘤免疫中的关键作用。通过计算细胞亚群在不同组织中的偏好性（RO/E分数），研究者识别出多个在肿瘤中特异性富集的细胞亚群，包括两个癌症相关成纤维细胞亚群（炎症性CAF和肌成纤维细胞性CAF）以及一个罕见的内皮细胞亚群。这个内皮细胞亚群特异性表达静脉内皮标志物ACKR1、选择素E（SELE）以及趋化因子CXCL9/10/11，类似于高内皮微静脉细胞，因此被命名为HEV-CXCL10亚群。空间转录组数据证实了该亚群的存在及其与T细胞在空间上的共定位。调控网络分析表明，干扰素-γ和肿瘤坏死因子是驱动该亚群表型的关键配体，其转录因子调控网络（如STAT1/2, IRF2/7）的激活塑造了其招募T细胞的免疫表型。此外，通过相关性分析揭示了肿瘤组织中细胞亚群之间独特的共现模式，例如巨噬细胞亚群与成纤维细胞之间的正相关，以及T/NK细胞亚群与基质细胞亚群之间的负相关，提示了它们在肿瘤发展中的功能关联。
3. 基于肿瘤微环境异质性的患者分层： 为了探究TME的个体间异质性，研究者基于每位患者TME中细胞亚群的相对丰度，对116名结直肠癌患者进行了无监督的层次聚类分析。结果将患者分为六个具有不同TME免疫表型的组别（G1-G6）。G1组以基质细胞（成纤维细胞和内皮细胞）富集、CD45+免疫细胞浸润稀少为特征；G2组富集单核细胞/巨噬细胞和树突状细胞；G3和G4组分别富集特定髓系细胞和浆细胞；G5组以CD8+ T细胞和NK细胞为主导；G6组则富集CD4+ T细胞和滤泡性B细胞。分析表明，这种分组主要源于患者个体间的差异，而非批次效应。该分类与已知的CMS分型有部分重叠但提供了更精细的划分：G1组与富含基质的CMS4型高度重合，且与上皮-间质转化和TGF-β信号通路的高激活相关，预后较差；G5和G6组则显示出与免疫激活型CMS1相似的特征。
4. 不同患者亚群的免疫逃逸机制探究： 研究者假设不同TME亚型的肿瘤会演化出不同的免疫逃逸机制，并对此进行了深入分析。 * G5组（CD8+ T细胞富集型）： 面临强烈的T细胞杀伤压力。分析发现，该组患者的肿瘤反应性CD8+ T细胞（CD8-CXCL13亚群）高表达多种共抑制分子（如PD-1, CTLA-4），呈现高度耗竭状态。同时，其恶性细胞也高表达PD-L1/PD-L2。这表明，上调PD-1/PD-L1轴可能是该组肿瘤免疫逃逸的主要机制。此外，研究还发现一个富集于G5组的CD4-CXCL13 T细胞亚群，其与CD8-CXCL13亚群共享相似的基因表达变化，且两者可能共同受DC细胞（特别是LAMP3+ DC）分泌的IL-15调控，提示存在一个潜在的免疫调节“三方轴”。 * G2组（巨噬细胞富集型）： 面临巨噬细胞介导的吞噬压力。研究发现，该组肿瘤中“别吃我”信号轴CD47-SIRPα在恶性细胞和巨噬细胞中高度激活，这可能是肿瘤抵抗巨噬细胞吞噬的重要机制。 * G4组（浆细胞富集型）： 该组肿瘤微环境中存在大量浆细胞（尤其是IgG+浆细胞）。研究者推测，为应对高水平的抗体，肿瘤可能下调巨噬细胞和NK细胞上的Fcγ受体，从而削弱抗体依赖性细胞吞噬作用和抗体依赖性细胞毒性。分析证实，G4组巨噬细胞中激活型Fc受体（如FCGR3A, FCGR2A）表达最低，且NK细胞中富集低表达FCGR3A的NK-XCL1亚群。在TCGA数据集中，浆细胞特征与Fc受体特征呈显著负相关，支持了这一假设。 * G6组（CD4+ T/B细胞富集型）： 该组富集调节性T细胞且多为微卫星稳定型。分析发现，该组患者CD8+ T细胞的细胞毒性相关基因整体表达水平较低，表明其细胞毒性功能可能受到抑制。空间转录组分析显示，G6组的特征基因与三级淋巴结构区域高度共定位，且与更好的预后相关。进一步分析发现，G6组中富集的B细胞、CD4+ T细胞和粘膜相关恒定T细胞高表达淋巴毒素β，巨噬细胞中TNF+比例也更高，这些因素可能共同促进了TLS的形成。 * G1组（基质细胞富集型）： 该组恶性细胞中与有氧呼吸和细胞因子介导的信号通路相关的基因表达下调，可能导致缺氧微环境，阻碍免疫细胞浸润。细胞间通讯分析显示，G1组中恶性细胞与成纤维细胞、内皮细胞之间的相互作用增强，特别是PDGFA-PDGFRA/B配体-受体对显著富集，这可能是恶性细胞招募成纤维细胞、构建免疫抑制性基质屏障的重要机制。
5. 结直肠癌遗传风险基因的细胞类型效应分析： 为了探索GWAS鉴定的结直肠癌风险基因在哪些细胞类型中发挥作用，研究者将风险基因映射到单细胞数据中，分析了这些基因在肿瘤与癌旁组织对比中，在不同细胞类型内的表达变化P值分布。结果显示，成纤维细胞和内皮细胞的P值分布偏离均匀分布的程度最大（Lambda统计量最高），表明这些基质细胞是结直肠癌遗传易感性的主要效应细胞类型。例如，COL4A2基因的上调主要发生在癌基质中。在成纤维细胞中差异表达的风险基因与上皮-间质转化相关，而在内皮细胞中则与细胞外基质组织和PDGFB信号通路相关，提示这些通路可能介导了遗传因素对基质细胞的影响，进而影响个体患癌风险。
三、 主要研究结果
本研究的主要结果可概括为以下几点： 1. 构建了迄今为止最大规模的人类结直肠单细胞转录组图谱，包含来自近200名供体、涵盖多种病理状态的67万余个细胞，系统描绘了结直肠组织的细胞异质性全景。 2. 揭示了肿瘤特异性转录重塑：发现了肿瘤中浆细胞亚型的转换（IgA+减少，IgG+增加），鉴定出两个肿瘤富集的癌症相关成纤维细胞亚群，并首次在结直肠癌中系统描述了一个具有T细胞招募潜能的罕见肿瘤特异性高内皮微静脉样内皮细胞亚群（HEV-CXCL10）。 3. 基于TME细胞组成将结直肠癌患者分为六个具有不同免疫表型的亚群（G1-G6）。该分层揭示了超越传统CMS分型的更精细的免疫微环境异质性，并与患者预后（如G1组差、G6组好）和分子特征（如MSI状态）相关联。 4. 阐明了不同患者亚群中癌细胞可能采用的不同免疫逃逸机制： * G5组：通过上调PD-1/PD-L1轴诱导T细胞耗竭。 * G2组：通过激活CD47-SIRPα“别吃我”信号轴抵抗巨噬细胞吞噬。 * G4组：通过下调巨噬细胞和NK细胞的Fcγ受体来削弱抗体依赖性免疫功能。 * G6组：CD8+ T细胞整体细胞毒性功能低下，且微环境富集三级淋巴结构。 * G1组：恶性细胞通过分泌PDGFA等因子招募成纤维细胞，构建免疫排斥性基质。 5. 将GWAS风险基因与单细胞转录谱关联，发现成纤维细胞和内皮细胞是结直肠癌遗传易感性的主要效应细胞类型，为理解遗传风险如何通过特定细胞类型影响疾病发生提供了新视角。
四、 研究结论与意义
本研究通过大规模单细胞数据整合分析，构建了一个全面的人类结直肠组织细胞图谱，并首次基于肿瘤微环境的细胞组成异质性，将结直肠癌患者系统性地分为六个亚群。研究不仅详细刻画了各亚群的细胞和分子特征，更重要的是揭示了不同亚群中癌细胞为适应其特定的免疫微环境压力而采用的截然不同的免疫逃逸策略。这一发现挑战了“一刀切”的免疫治疗思路，强调了结直肠癌免疫治疗的个性化必要性。例如，对于G5组患者，PD-1/PD-L1抑制剂可能更有效；对于G2组患者，靶向CD47-SIRPα轴可能是潜在策略；而对于G4组患者，则需要考虑如何克服Fcγ受体下调带来的治疗抵抗。此外，研究将遗传风险定位到特定的基质细胞类型，为从细胞层面理解结直肠癌的遗传易感性提供了重要线索。该研究为深入理解结直肠癌的发病机制、患者分层和个性化免疫治疗开发提供了宝贵的资源和新的见解。
五、 研究亮点
六、 其他有价值的内容
研究还探讨了三级淋巴结构在G6组患者中的可能作用，发现该组富集的免疫细胞（如B细胞、特定T细胞亚群）可能是淋巴毒素β的来源，而巨噬细胞中TNF的高表达也可能参与TLS的形成，这为理解TLS在结直肠癌中的形成机制和功能提供了线索。同时，作者也坦诚地指出了研究的局限性，包括单细胞技术本身对中性粒细胞等细胞的采样偏差、不同数据集间潜在的批次效应影响（尽管已通过多种分析验证其影响有限）、肿瘤内异质性对取样的影响，以及缺乏功能性实验验证等，为未来研究指明了方向。