这是一篇关于头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）突变图谱的原始研究论文，由Nicolas Stransky、Ann Marie Egloff、Aaron D. Tward等来自Broad Institute of MIT and Harvard、University of Pittsburgh、Dana-Farber Cancer Institute等多个机构的研究者共同完成，通讯作者为Levi A. Garraway和Jennifer R. Grandis。该研究于2011年7月28日在线发表在《Science》杂志上，标题为《The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma》。

研究背景与目的

头颈部鳞状细胞癌是全球第六常见的非皮肤性恶性肿瘤，每年约有60万新发病例，死亡率约为50%。其主要危险因素包括烟草使用、酒精摄入以及人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染。尽管在流行病学和发病机制方面已有较多认识，但在过去四十年中，许多类型HNSCC的生存率改善甚微。因此，深入了解HNSCC的分子发病机制，对于推动治疗手段的发展具有重要意义。此前的研究虽然已发现TP53、CDKN2A、PTEN、PIK3CA和HRAS等基因在HNSCC中发生突变，但对整个肿瘤基因组层面的突变谱仍缺乏系统认识。本研究旨在通过全外显子组测序技术，系统描绘HNSCC的突变谱，鉴定新的驱动基因和信号通路，从而为该疾病的发生机制提供更全面的分子图景。

研究流程与方法

研究团队收集了来自92例HNSCC患者的肿瘤组织及配对外周血DNA样本，肿瘤部位覆盖口腔、口咽、下咽、喉和鼻腔鼻窦等主要解剖位置。在临床信息方面，89%的患者报告有烟草使用史，79%有饮酒史。研究首先对样本进行了HPV检测，采用HPV-16聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）和原位杂交方法，结果显示14%的全部肿瘤和53%的口咽部肿瘤为HPV阳性。随后，研究者利用单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）阵列进行肿瘤拷贝数分析，复现了既往报道中常见的CCND1扩增、CDKN2A缺失以及少见的MYC、EGFR、ERBB2、CCNE1扩增，表明该样本集合在遗传学上具有代表性。

在测序流程方面，研究采用溶液相杂交捕获和全外显子组测序技术，对肿瘤与正常血液配对样本进行分析。测序深度达到了靶向外显子区域平均150倍覆盖，其中87%的位点覆盖深度超过20倍。在初步分析中，研究排除了18例存在广泛基质混杂的肿瘤，最终保留74例样本用于后续分析。此外，研究还对一例口咽肿瘤和一例下咽肿瘤进行了全基因组测序，平均覆盖深度为31倍，以检测基因组结构变异。在突变验证方面，研究从外显子组测序发现的编码突变中抽取了321个进行质谱基因分型验证，验证成功率为89.7%；当突变等位基因分数超过总DNA的20%时，验证率提高至95.7%，提示质谱基因分型的敏感性在基质混杂较高的样本中可能下降。

在数据分析流程中，研究使用MutSig算法识别具有统计学显著性的突变基因。该算法通过比较每个基因的实际突变数量与基于总突变数估计的随机期望值，确定哪些基因受到正向选择。研究还使用PathSeq算法对测序读段进行病毒序列比对，以检测HPV感染状态。同时，研究对全基因组测序数据进行了高置信度体细胞重排分析，并通过SNP阵列验证了局部拷贝数变化。为了寻找功能相关的突变基因集，研究将q值小于0.25的76个基因纳入分析，并检查这些基因在功能性基因集中的富集情况。

主要研究结果

研究结果显示，HNSCC平均每个肿瘤携带130个编码区突变，其中25%为同义突变。整体突变率与其他吸烟相关恶性肿瘤（如小细胞肺癌和肺腺癌）相当。HPV阳性肿瘤的突变率约为HPV阴性肿瘤的一半（平均每兆碱基2.28个突变对比4.83个突变，p=0.004），这与流行病学研究中HPV阳性与阴性HNSCC具有生物学差异的观点一致。在两例全基因组测序的肿瘤中，分别检测到19个和111个高置信度体细胞重排。

在碱基替换谱方面，非CpG位点的鸟苷到胸苷（G→T）颠换频率平均为12%±6%，这一特征与烟草暴露相符。在报告吸烟史的患者中，G→T颠换比例较高的肿瘤表现出整体突变率升高的趋势（p=0.02）。值得注意的是，即使限制在HPV阴性肿瘤中，喉癌仍表现出比口腔、口咽、下咽和鼻腔鼻窦癌更高的突变率和G→T颠换频率（p=0.008和p<0.0001），提示不同解剖部位的HNSCC可能存在不同的突变机制。

MutSig分析鉴定了39个具有高度统计学显著性突变的基因（假发现率q<0.1）。其中，TP53、CDKN2A、HRAS、PTEN和PIK3CA是已知的HNSCC相关基因，验证了该方法的可靠性。TP53是最常见的突变基因，此外在一例肿瘤中还发现了100kb的缺失并通过SNP阵列验证。更重要的是，研究发现了大量此前未在HNSCC中涉及的基因。NOTCH1突变出现在11%的肿瘤中，另有2例肿瘤存在局灶性缺失；NOTCH2或NOTCH3的非同义点突变出现在11%的样本中，另有1例NOTCH3局灶性缺失。与T细胞急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病中NOTCH1的激活性突变不同，HNSCC中的NOTCH突变主要表现为功能缺失型，包括产生截短蛋白的无义突变、位于配体结合域的错义突变和剪接位点突变，这些突变可能导致NOTCH信号通路失活。

在功能基因集富集分析中，最高得分的基因集与表皮发育相关，显著突变基因包括NOTCH1、IRF6和TP63。这些基因均与鳞状上皮分化密切相关。进一步检查发现，另有11个携带破坏性突变的基因也在鳞状分化程序中发挥作用，包括RIPK4、CDH1、EZH2和DICER1等。综合来看，至少30%的肿瘤在调控鳞状分化的基因中携带突变。研究还发现SYNE1和SYNE2分别在20%和8%的样本中发生突变，这两个基因与核极性调控有关；RIMS2和PCLO突变分别见于11%和12%的病例，其编码蛋白参与钙感应，而钙信号对终末鳞状分化至关重要。此外，凋亡相关基因CASP8（8%）和DDX3X（4%）以及组蛋白甲基转移酶PRDM9（11%）和EZH2（6%）也存在反复突变。

在HPV检测方面，PathSeq算法在14例肿瘤（19%）中识别出HPV-16序列读段，其中11例经PCR验证为阳性。测序检出的HPV状态与TP53突变呈负相关（p=0.001）。这些结果表明，大规模平行测序可以同时检测人类和非人类病原体序列，为肿瘤标本的病因学分析提供了有力工具。

研究结论与意义

本研究通过全外显子组测序系统描绘了HNSCC的突变谱，揭示了鳞状细胞分化程序的遗传学破坏是该恶性肿瘤的一个主要驱动机制。研究提出，HNSCC的发病可能涉及分化阻滞或谱系依赖性，其突变病因具有多样性，不同于白血病和前列腺癌等仅由少数靶基因驱动的发育病理过程。从临床应用角度看，由于NOTCH通路抑制剂已进入临床试验，而本研究发现的NOTCH1功能缺失突变提示，使用γ-分泌酶抑制剂的患者可能需要监测皮肤和头颈部鳞状恶性肿瘤的发生。此外，测序检测HPV的方法为肿瘤病因学诊断提供了新的技术途径。该研究也证明了对大量肿瘤-正常配对样本进行全外显子组测序，能够为肿瘤生物学提供新的基本认识，并对多种人类癌症具有广泛的相关性。

研究亮点

本研究的突出之处在于：第一，首次在HNSCC中系统鉴定了以NOTCH1、IRF6和TP63为代表的鳞状分化相关基因的反复突变，揭示了鳞状分化程序失调作为HNSCC致癌的重要机制；第二，将全外显子组测序与HPV检测相结合，展示了测序技术在病原体检测中的潜力；第三，通过全基因组测序发现结构变异，并结合SNP阵列验证，提供了HNSCC基因组复杂性的多层面证据；第四，研究样本覆盖多种解剖部位，并整合了详细的临床信息，使得对突变谱与吸烟、HPV状态及肿瘤部位之间关系的分析成为可能。