本文属于类型a，即单一原创研究的学术报告。

一、研究作者、机构及发表信息

该研究由Fábio França Vieira e Silva、Guillermo Prada-Ramallal、Marina Di Domenico、María Elena Padín-Iruegas、Laura Isabel Rojo-Álvarez、Susana Belén Bravo-López、Paola Della Monica、Federica Colapietra、Andrea Ballini及José Manuel Cameselle-Teijeiro等学者合作完成。研究机构主要包括西班牙圣地亚哥德孔波斯特拉大学临床医院、圣地亚哥德孔波斯特拉健康研究所、意大利坎帕尼亚大学“路易吉·万维泰利”精准医学系以及西班牙维戈大学功能生物学与健康科学系等。该研究发表于Virchows Archiv，在线发表日期为2026年4月，论文标题为《MLH1 promoter methylation, mismatch repair and intestinal differentiation markers in papillary thyroid carcinoma: real-world evidence from Galicia (northwest Spain)》。

二、研究背景与目的

甲状腺癌是全球第十大常见恶性肿瘤，2022年新发病例约82万例，死亡约4.7万例。在滤泡细胞起源的甲状腺恶性肿瘤中，甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma, PTC）是最常见的亚型，占所有甲状腺癌的80%–85%。尽管PTC总体预后较好，但仍有部分病例表现出侵袭性行为，因此需要更精细的分子与免疫组织化学特征来改善诊断准确性和预后分层。

甲状腺与胃肠道在胚胎发育中均起源于内胚层，这一共同的发育背景提示甲状腺肿瘤可能表达某些肠道分化标志物或出现DNA错配修复（mismatch repair, MMR）通路的异常。CDX2和SATB2是外科病理中广泛应用的肠道分化标志物，尤其在结直肠腺癌诊断中具有重要作用。MLH1启动子甲基化是导致MMR缺陷的重要表观遗传机制之一。既往关于PTC中MLH1甲基化、MMR蛋白表达以及CDX2、SATB2表达的数据有限且不一致。本研究旨在分析PTC中MLH1启动子甲基化状态及MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、SATB2和CDX2蛋白表达，并将这些表观遗传与免疫组化结果与临床病理及分子特征、无进展生存期（progression-free survival, PFS）进行相关性分析。

三、研究流程与方法

研究共纳入63例PTC患者，所有病例均来自西班牙加利西亚地区圣地亚哥德孔波斯特拉大学临床医院2017年至2023年间诊断的原发性PTC手术标本。纳入标准包括：原发性PTC手术样本、年龄大于18岁、既往已有免疫组化和分子分析数据、且有截至2025年9月的随访资料。研究通过加利西亚卫生服务数据库（IANUS）筛选病例。该研究获得了圣地亚哥-卢戈医学研究伦理委员会批准（编号：2023/532）。

研究包含以下主要实验步骤。第一，临床病理数据提取：收集患者性别、诊断年龄、既往甲状腺疾病史、TNM分期、组织学亚型、神经周围侵犯、静脉侵犯、甲状腺外侵犯、复发、转移、死亡及随访时间等变量；TNM分期依据第八版美国癌症联合委员会（AJCC）标准，组织学亚型依据第五版WHO内分泌与神经内分泌肿瘤分类重新评估。第二，免疫组织化学分析：对石蜡包埋肿瘤组织切片进行多种抗体染色，包括甲状腺球蛋白、降钙素、p53、Ki-67、PTEN、CD56、甲状腺过氧化物酶、半乳糖凝集素-3、HBME-1、TTF1/NKX2-1、PAX8、MLH1、PMS2、MSH2、MSH6、SATB2和CDX2等。第三，TERT启动子（TERTp）突变分析：通过PCR扩增TERT启动子区域热点−146（C250T）和−124（C228T），并采用Sanger测序法检测突变。第四，KRAS、BRAF和NRAS突变分析：使用cobas 4800系统及配套的KRAS突变检测试剂盒和BRAF/NRAS突变检测试剂盒，按照制造商指南进行突变检测，涵盖BRAF外显子15、外显子11，NRAS外显子2、3、4以及KRAS外显子2、3、4的常见突变位点。第五，MLH1启动子甲基化分析：从福尔马林固定石蜡包埋肿瘤组织中提取基因组DNA，使用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit进行亚硫酸氢盐转化，采用PyroMark PCR Kit进行PCR扩增，并在PyroMark Q24平台上使用PyroMark Q24 CpG MLH1试剂盒进行焦磷酸测序。该检测覆盖MLH1启动子区域chr3:36,993,279–36,993,309（参考基因组GRCh38.p14）。甲基化水平以11%为界值，≥11%判定为甲基化阳性。第六，统计分析：采用Spearman秩相关评估连续或等级变量间的相关性，使用卡方检验分析临床病理参数与分子标志物间的关联；PFS采用Kaplan-Meier法估计，并用log-rank检验进行单因素分析；单因素分析中P<0.05的变量进入多因素Cox比例风险回归模型。所有分析在R软件中完成。

四、主要研究结果

在63例PTC中，组织学亚型分布为：经典型50.8%（32例）、滤泡型23.8%（15例）、高细胞型15.8%（10例）、实体型4.8%（3例）、嗜酸细胞型1.6%（1例）、Warthin样型1.6%（1例）和柱状细胞型1.6%（1例）。患者平均诊断年龄为50.2岁（范围18–81岁）。发生疾病进展的16例中，经典型占43.8%，滤泡型和高细胞型各占18.8%。8例发生远处转移，其中肺转移5例（62.5%），骨转移3例（37.5%）。7例死亡患者中，滤泡型3例（42.9%）、高细胞型2例（28.6%）、经典型1例（14.3%）、柱状细胞型1例（14.3%）。

分子检测结果显示，4例携带TERTp突变，且均位于c.−124 C>T热点，其中3例为经典型、1例为滤泡型。BRAF突变共3例（4.8%），未显示特定亚型偏好；KRAS突变2例（3.2%）均见于滤泡型；NRAS突变8例（12.7%），分布于经典型、滤泡型、柱状细胞型和实体型。免疫组化方面，所有63例PTC均保留MLH1、PMS2、MSH2和MSH6蛋白表达，未检出MMR缺陷。MLH1启动子平均甲基化水平为3.5%（范围1%–20%），仅3例（4.8%）判定为甲基化阳性，分别属于经典型、滤泡型和实体型。值得注意的是，这3例甲基化阳性的肿瘤仍保留MLH1蛋白表达，其中1例显示MLH1/PMS2弱表达。CDX2仅在2例（3.2%）中呈阳性，分别属于经典型和滤泡型，且表现为弥漫和局灶阳性模式；SATB2在所有63例中均为阴性。

临床病理与分子特征的相关性分析显示，年龄≥55岁与甲状腺外侵犯、较高分期、静脉侵犯、神经周围侵犯、p53突变型表达模式、TERTp突变及死亡显著相关。男性与CDX2阳性（P=0.018）及死亡（P<0.001）相关。CDX2阳性还与较高T分期相关（P<0.001）。静脉侵犯与转移（P=0.008）及死亡（P=0.028）相关。在生存分析中，单因素分析显示仅静脉侵犯显著影响PFS，风险比（hazard ratio, HR）为3.34（95%置信区间1.27–8.76；P=0.014）。由于单因素分析中其他变量均未达到显著水平，未进行多因素分析。MLH1启动子甲基化、MMR蛋白表达、CDX2或SATB2表达均未显示与PFS相关。

五、研究结论与意义

本研究证实，在PTC中MLH1启动子甲基化、MMR缺陷以及CDX2和SATB2表达均为罕见事件，且未显示对PFS具有影响。尽管CDX2表达罕见，但其并非仅局限于柱状细胞亚型，也可出现于经典型和滤泡型PTC中。所有PTC均保留MMR蛋白表达，即使存在MLH1启动子高甲基化也未导致蛋白丢失，这支持了在常规实践中优先采用两抗体或四抗体免疫组化组合检测MMR状态的建议，因为启动子甲基化并不总是等同于蛋白表达缺失。

研究的科学价值在于，它从真实世界队列出发，填补了PTC中肠道分化标志物和MMR状态数据不足的空白，并对MLH1启动子甲基化与蛋白表达之间的关系提供了直接证据。应用价值方面，本研究提示在非综合征性PTC中常规筛查MMR缺陷或MLH1甲基化的临床意义有限。更重要的是，研究再次确认了静脉侵犯作为PTC复发或转移的独立预测因素，强调了经典组织病理学参数在风险分层中的持续重要性。

六、研究亮点

本研究的亮点主要体现在以下几个方面：第一，研究聚焦于PTC中既往研究较少但具有胚胎学合理性的肠道分化标志物和MMR通路改变，角度新颖。第二，采用焦磷酸测序定量检测MLH1启动子甲基化，能够提供精确的甲基化水平数据，而非仅定性判断。第三，研究同时整合了免疫组化、分子突变检测、表观遗传分析和长期随访数据，形成了较为完整的多维度分析体系。第四，研究基于加利西亚地区人群的真实世界数据，该人群在甲状腺癌的地理和遗传异质性研究中代表性不足，因此具有特定的人群参考价值。

七、其他有价值内容

研究还指出，BRAF突变虽然是最常见的PTC分子改变之一，但在本队列中并未显示出一致的预后价值，这与既往部分多因素研究结论一致。TERTp突变与高龄和较高T分期相关，但未能在本研究中独立影响PFS。此外，研究提到既往文献中SATB2在间变性甲状腺癌中表达率可达74%，而在分化型甲状腺癌中基本为阴性，本研究结果与这一趋势一致，进一步说明SATB2在分化型甲状腺癌中的应用价值有限。研究还讨论了甲状腺肿瘤与结直肠肿瘤在家族性腺瘤性息肉病等遗传综合征中的关联，但在非综合征性PTC中，MLH1甲基化和MMR缺陷的罕见性提示其致病作用有限。研究的局限性包括回顾性设计、样本量相对较小以及中位随访时间3.4年可能不足以充分反映PTC的长期预后。尽管如此，该研究为理解PTC中肠道分化标志物和MMR通路改变提供了有价值的真实世界证据。