弥漫性大B细胞淋巴瘤中糖蛋白PTGDS通过MYH9介导调控Wnt–β-catenin–STAT3信号通路促进肿瘤发生

第一，研究团队与发表信息 本研究由中国山东大学齐鲁医学院山东省立医院血液科的孙峰胡、任帅、蔡一清、刘佳瑞、韩洋、赵毅、杨娟等研究人员共同完成，通讯作者为周向向（Xiangxiang Zhou）和王欣（Xin Wang）。该研究成果以题为《Glycoprotein PTGDS promotes tumorigenesis of diffuse large B-cell lymphoma by MYH9-mediated regulation of Wnt–β-catenin–STAT3 signaling》的论文形式，于2021年11月6日在线发表于《Cell Death & Differentiation》期刊（2022年第29卷，第642-656页）。

第二，学术背景与研究目的 本研究属于血液肿瘤学与分子生物学交叉领域，聚焦于弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse Large B-Cell Lymphoma， DLBCL）的发病机制与治疗新靶点探索。DLBCL是最常见的非霍奇金淋巴瘤，侵袭性强且具有高度异质性。尽管靶向治疗取得进展，仍有40-50%的患者出现难治或复发，最终死于疾病进展。因此，寻找新的治疗靶点至关重要。

糖蛋白前列腺素D2合酶（Prostaglandin D2 synthase， PTGDS）是脂质运载蛋白超家族成员，具有催化前列腺素D2（PGD2）生成和转运脂质物质的双重功能。既往研究表明，PTGDS在多种实体瘤中的表达和作用存在矛盾，既有促癌也有抑癌的报道，且其在血液系统恶性肿瘤（特别是DLBCL）中的作用和机制尚不明确。此外，PTGDS存在糖基化修饰，但其在DLBCL中的生物学意义未知。AT56是一种口服活性、选择性PTGDS抑制剂。

基于以上背景，本研究旨在：（1）探索PTGDS在DLBCL中的表达水平及其与临床预后的关系；（2）阐明PTGDS在DLBCL进展中的生物学功能；（3）评估PTGDS抑制剂AT56在DLBCL治疗中的潜力；（4）揭示PTGDS促进DLBCL进展的分子机制，特别是其与MYH9及Wnt–β-catenin–STAT3信号通路的关联；（5）探讨PTGDS糖基化修饰对其功能的影响。

第三，详细研究流程与方法 本研究是一项综合性实验研究，整合了临床样本分析、体外细胞实验、体内动物模型、分子互作与机制探索等多个层面，流程复杂且环环相扣。

流程一：临床样本分析与PTGDS表达相关性研究 * 研究对象与样本量： 收集了2012年至2019年间120例新诊断DLBCL患者的石蜡包埋组织样本，以及32例反应性增生（Reactive Hyperplasia）患者的对照样本。此外，收集了53例DLBCL患者和17例健康志愿者的血清样本。从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离正常CD19+ B细胞作为对照。使用了LY1、LY3、LY8、Val和U2932等DLBCL细胞系。 * 实验方法与处理： 1. 免疫组织化学（IHC）与评分： 对组织样本进行PTGDS蛋白的IHC染色，由两位不知情的观察者独立评分（比例分×强度分），定义8-12分为阳性表达。同时进行CD10、Ki67等标志物染色。 2. 酶联免疫吸附测定（ELISA）： 检测血清中可溶性PTGDS水平以及细胞培养上清中PGD2的浓度。 3. 蛋白质印迹法（Western Blotting）： 检测DLBCL细胞系及正常B细胞中PTGDS的蛋白表达水平。 4. 数据分析： 使用SPSS软件进行统计分析，将PTGDS表达水平与患者的临床病理特征（如亚型、涎酸水平、疗效等）及生存期（通过Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验）进行关联分析。

流程二：PTGDS在DLBCL中的生物学功能验证（体外与体内） * 研究对象： 主要为DLBCL细胞系（如LY1, LY3）。 * 实验方法与处理： 1. 功能获得与功能缺失实验： 使用携带PTGDS短发夹RNA（shRNA）或过表达序列的慢病毒载体转染细胞，构建稳定敲低（sh-PTGDS）或过表达（lv-PTGDS）PTGDS的细胞系。同时使用重组人PTGDS蛋白（rhPTGDS）和PGD2处理细胞。 2. 细胞功能检测： * 增殖与活力： 采用CCK-8法和CellTiter-Glo发光法检测细胞增殖与活力。 * 细胞周期与凋亡： 使用流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡率。 * 细胞侵袭： 使用基质胶包被的Transwell小室评估细胞侵袭能力。 3. 相关蛋白表达检测： 通过Western Blotting检测增殖（c-Myc）、周期（Cyclin D1, CDK2, p21）、凋亡（Bax, Bcl-xL, cleaved Caspase-³⁄₉, cleaved PARP）和侵袭（ZEB1, Vimentin）相关蛋白的表达变化。 4. 体内异种移植瘤模型： 将稳定转染的LY1细胞（对照组、sh-PTGDS组、lv-PTGDS组）皮下注射到BALB/c裸鼠后腿，定期测量肿瘤体积和重量。实验结束时使用小动物活体成像系统检测肿瘤生物发光强度，并对瘤体进行IHC和Western Blotting分析。

流程三：PTGDS抑制剂AT56的疗效及对化疗敏感性影响评估 * 研究对象： DLBCL细胞系。 * 实验方法与处理： 1. AT56处理： 用不同浓度的AT56处理细胞，验证其对PGD2产生的抑制效果及特异性（在sh-PTGDS细胞中效果减弱）。 2. 功能检测： 重复进行上述细胞增殖、活力、周期、凋亡和侵袭实验。 3. 联合化疗药物实验： 将AT56与阿霉素（Adriamycin）或苯达莫司汀（Bendamustine）联合处理细胞，评估其对细胞增殖和凋亡的协同效应。 4. DNA损伤评估： * 彗星实验（Comet Assay）： 单细胞凝胶电泳检测DNA损伤程度（尾矩）。 * 免疫荧光与Western Blotting： 检测DNA损伤标志物磷酸化H2AX（p-H2AX）的表达水平。

流程四：PTGDS作用机制探索——MYH9互作与信号通路调控 * 研究对象： DLBCL细胞系。 * 实验方法与处理： 1. 蛋白质相互作用鉴定： 使用免疫共沉淀联合质谱分析（Co-IP/MS）筛选与PTGDS相互作用的蛋白，并对结果进行生物信息学分析。 2. 互作验证： 通过Co-IP和免疫荧光共定位实验，验证PTGDS与筛选出的关键蛋白MYH9之间的内源性相互作用。 3. MYH9功能研究： 使用shRNA敲低MYH9或用MYH9抑制剂（Blebbistatin）处理细胞，评估其对DLBCL细胞增殖、周期、凋亡和侵袭的影响。 4. 下游信号通路分析： * 通过Western Blotting检测PTGDS或MYH9抑制后，Wnt通路关键分子（LRP6, p-GSK3β, β-catenin, TCF4）、STAT3及其磷酸化水平的变化。 * 通过qRT-PCR检测β-catenin和STAT3的mRNA水平变化，区分转录与蛋白降解调控。 * Co-IP实验： 验证MYH9与GSK3β之间的相互作用。 * 泛素化与蛋白稳定性检测： 使用蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHX）追踪实验，检测PTGDS/MYH9抑制对GSK3β泛素化修饰和半衰期的影响。 * 染色质免疫共沉淀（ChIP）实验： 验证转录因子TCF4在STAT3启动子区的结合。 5. 拯救实验： * 使用Wnt通路激动剂Wnt3a处理细胞，观察是否能逆转AT56对细胞功能和信号通路的抑制作用。 * 使用STAT3抑制剂WP1066处理细胞，观察是否能增强AT56的疗效或逆转PTGDS过表达引起的增殖促进作用。 * 使用Blebbistatin处理PTGDS过表达的细胞，观察是否能逆转其促增殖效应和Wnt–β-catenin–STAT3通路的激活。

流程五：PTGDS糖基化修饰对其功能的影响 * 研究对象： DLBCL细胞系。 * 实验方法与处理： 1. 糖基化位点预测与验证： 基于UniProt数据库预测PTGDS糖基化位点。使用糖基化抑制剂衣霉素（Tunicamycin）或去糖基化酶PNGase F处理细胞，通过Western Blotting观察PTGDS蛋白分子量的变化，验证其糖基化状态。 2. 糖基化对亚细胞定位和稳定性的影响： 通过细胞核质分离Western Blotting和免疫荧光观察衣霉素处理或糖基化位点突变后，PTGDS的亚细胞定位变化（是否发生核转位）。通过CHX追踪实验检测去糖基化对PTGDS蛋白半衰期的影响。 3. 定点突变构建： 构建PTGDS糖基化位点（Asn51和Asn78）的单点或双点突变质粒（如flag-PTGDS-△51, ha-PTGDS-△78），转染细胞。 4. 功能评估： 检测糖基化缺陷型PTGDS突变体对细胞增殖及相关蛋白（c-Myc）表达的影响。

第四，主要研究结果 结果一： PTGDS在DLBCL中高表达且与不良预后相关。IHC结果显示DLBCL组织中PTGDS表达显著高于反应性增生组织。DLBCL患者血清PTGDS水平也高于健康对照。高表达PTGDS与DLBCL的GCB亚型、高涎酸水平及治疗反应不佳显著相关。生存分析显示，PTGDS阳性（尤其是非GCB亚型）患者具有更短的无进展生存期和总生存期。

结果二： PTGDS在体外和体内均发挥促癌作用。GO分析提示PTGDS参与增殖、凋亡等过程。功能实验证实，rhPTGDS或PGD2处理可促进DLBCL细胞增殖；PTGDS过表达促进增殖，而敲低则抑制细胞活力与增殖，并下调c-Myc表达。体内实验显示，过表达PTGDS的移植瘤生长更快、体积重量更大、生物发光更强；敲低PTGDS则效果相反。此外，PTGDS敲低导致细胞周期G0/G1期阻滞（伴随Cyclin D1和CDK2下调）、凋亡增加（伴随促凋亡蛋白上调、抗凋亡蛋白Bcl-xL下调）以及侵袭能力减弱（伴随ZEB1和Vimentin下调）。

结果三： PTGDS抑制剂AT56在DLBCL中表现出显著抗肿瘤活性。AT56能有效抑制PGD2产生，并以剂量和时间依赖性方式抑制DLBCL细胞增殖、诱导G0/G1期阻滞、促进凋亡、抑制侵袭。这些效应在sh-PTGDS细胞中减弱，证明了AT56作用靶点的特异性。体内实验同样证实AT56能显著抑制移植瘤的生长，并调控瘤体内相关蛋白的表达。

结果四： PTGDS抑制可增强DLBCL细胞对化疗药物的敏感性。AT56与阿霉素或苯达莫司汀联用，产生了协同的细胞增殖抑制和凋亡诱导效应。机制上，AT56处理或PTGDS敲低能诱导DNA损伤（彗星实验尾矩增加，p-H2AX表达上调），这可能是其增敏化疗的途径之一。

结果五： PTGDS通过结合并调控MYH9激活Wnt–β-catenin–STAT3通路。Co-IP/MS筛选及验证发现PTGDS与MYH9存在直接相互作用。敲低MYH9或用其抑制剂Blebbistatin处理，能重现PTGDS抑制所观察到的抗肿瘤表型。机制深入研究表明，PTGDS抑制或敲低导致MYH9蛋白表达下降。MYH9被发现与GSK3β相互作用。PTGDS/MYH9抑制减少了GSK3β的泛素化修饰，延长了其半衰期。稳定的GSK3β促进了β-catenin的降解，从而抑制了经典Wnt通路。同时，ChIP实验证明Wnt通路下游转录因子TCF4能结合STAT3启动子，PTGDS/MYH9抑制也下调了STAT3的mRNA和蛋白水平。拯救实验进一步证实：Wnt3a可部分逆转AT56的效应；STAT3抑制剂WP1066能增强AT56疗效；Blebbistatin可逆转PTGDS过表达引起的促增殖和通路激活效应，但不改变PTGDS本身表达。这些结果构建了“PTGDS → MYH9 → （抑制GSK3β泛素化降解） → 激活Wnt/β-catenin通路 → 激活STAT3转录”的分子轴。

结果六： PTGDS的异常糖基化影响其功能。研究发现DLBCL细胞中PTGDS的糖基化水平低于正常B细胞。PTGDS蛋白存在Asn51和Asn78两个N-糖基化位点。抑制糖基化（衣霉素处理）或突变糖基化位点会导致PTGDS发生核转位、蛋白降解减缓、半衰期延长。这种低糖基化、更稳定的PTGDS突变体能更有效地促进细胞增殖。这在一定程度上解释了为何DLBCL中PTGDS蛋白高表达而其mRNA水平可能不高的矛盾现象。

第五，研究结论与价值 本研究首次系统揭示了糖蛋白PTGDS在DLBCL中的致癌作用及其分子机制。主要结论为：PTGDS在DLBCL（尤其是非GCB亚型）中高表达且与不良预后相关；PTGDS通过结合并稳定MYH9蛋白，进而抑制GSK3β的泛素化降解，激活Wnt–β-catenin–STAT3信号通路，从而促进DLBCL细胞的增殖、存活、侵袭并抑制凋亡；PTGDS的异常低糖基化修饰通过促进其核转位和稳定化，增强了其促癌功能；PTGDS选择性抑制剂AT56在体外和体内均显示出显著的抗DLBCL活性，并能增标准化疗药物的疗效。

本研究的科学价值在于：首次阐明了PTGDS在血液恶性肿瘤中的明确促癌角色和详细作用机制，发现了PTGDS-MYH9-Wnt/β-catenin-STAT3这一新的致癌信号轴，并揭示了PTGDS翻译后糖基化修饰在其功能调控中的关键作用。应用价值在于：将PTGDS确立为DLBCL一个全新的潜在预后标志物和治疗靶点；为PTGDS抑制剂AT56作为DLBCL新型治疗策略（包括单药或与化疗、STAT3抑制剂等联合应用）提供了坚实的临床前实验依据，具有重要的转化医学前景。

第六，研究亮点 1. 研究新颖性： 这是首次在DLBCL乃至血液肿瘤领域全面研究PTGDS的功能、机制及治疗意义，填补了该领域的知识空白。 2. 机制深度： 研究从蛋白互作（发现PTGDS与MYH9结合）、信号通路（阐明了从PTGDS到Wnt/β-catenin再到STAT3的完整调控链条）、翻译后修饰（揭示了糖基化对PTGDS稳定性与功能的影响）多个层面深入解析了PTGDS的致癌机制，逻辑严密，证据链完整。 3. 转化潜力突出： 不仅进行了基础机制探索，还重点评估了靶向药物AT56的疗效，并探索了其与现有化疗方案的协同作用，直接指向临床转化。 4. 方法全面系统： 整合了临床样本分析、生物信息学、多种体外功能实验、体内动物模型、分子互作鉴定、蛋白修饰研究等多种技术手段，构成了一个立体、系统的研究体系。

第七，其他有价值内容 本研究还包含了详尽的材料与方法描述，如患者信息、细胞培养条件、试剂来源、质粒构建、实验具体步骤（如IHC评分标准、Co-IP流程、CHX实验方法等）以及详细的统计分析方法，确保了研究的可重复性。此外，论文提供了丰富的补充图表，包含了患者临床特征、质谱结果、额外的验证数据等，进一步支撑了主要结论。研究获得了中国国家自然科学基金等多个项目的资助，并遵循了相关的伦理规范。