本研究由来自中山大学第七附属医院研究中心、第三军医大学（现陆军军医大学）组织学与胚胎学系/重庆市神经生物学重点实验室等多个国内外知名机构的Qi Wang、Xiaomin Huang等学者共同完成，并于2022年7月5日在线发表于国际神经科学顶级期刊《Brain》（2022年第145卷第12期，第4474-4488页）。这项工作聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）早期血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）功能障碍的机制，并探索了Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路作为潜在治疗靶点的可能性。
研究的学术背景根植于神经退行性疾病和血管神经生物学领域。尽管阿尔茨海默病的病理机制研究已持续多年，但现有疗法在阻止或逆转疾病进展方面仍面临巨大挑战。近年来，越来越多的证据表明，血脑屏障的功能障碍，特别是在疾病早期阶段，是阿尔茨海默病病理生理学的一个重要贡献者。血脑屏障由脑内皮细胞（Brain Endothelial Cells, BECs）、基底膜、周细胞和星形胶质细胞终足构成，其完整性依赖于内皮细胞间的紧密连接蛋白（如claudin-5）和特定的转运蛋白（如葡萄糖转运蛋白GLUT-1）。然而，导致阿尔茨海默病中血脑屏障和脑内皮细胞功能损害的分子机制尚不完全清楚，且目前鲜有能够直接靶向并改善血脑屏障功能的分子。同时，Wnt信号通路（尤其是经典的Wnt/β-catenin通路）已知对脑内皮细胞的发育和血脑屏障的维持至关重要，但该通路在阿尔茨海默病相关内皮细胞功能障碍中的具体作用和调控机制仍未明确。因此，本研究旨在：1）在人和小鼠阿尔茨海默病模型中确认血脑屏障/脑内皮细胞功能障碍的存在及其发生时间点；2）探究Aβ淀粉样蛋白如何影响脑内皮细胞内的Wnt信号通路；3）寻找并验证通过特异性激活相关通路来修复血脑屏障功能的新治疗策略。
研究流程详细而系统，包含了从临床样本验证、动物模型分析、体外细胞机制探索到新型干预手段测试等多个环节。首先，研究团队获取了5例阿尔茨海默病患者和年龄性别匹配的健康对照者的尸检脑组织样本（具体信息见补充表1）。他们采用优化的免疫组织化学双重染色方法，检测了海马和皮层中Aβ斑块、血液来源的纤维蛋白原（fibrinogen，血管渗漏标志物）的积聚情况，以及脑内皮细胞标志物CD31共定位的紧密连接蛋白claudin-5和GLUT-1的表达水平。结果显示，阿尔茨海默病患者脑组织中存在Aβ斑块，血管周围有纤维蛋白原积聚，且claudin-5和GLUT-1的表达显著降低，这直接证实了患者脑中存在血脑屏障功能障碍和脑内皮细胞损伤。其次，为了明确功能障碍发生的时间线，研究使用了APPswe/PS1dE9 (APP/PS1)转基因小鼠模型，在不同月龄（2、4、9个月）进行分析。通过免疫荧光染色，他们发现小鼠海马区Aβ沉积始于4月龄，9月龄时显著增加。更重要的是，在4月龄的APP/PS1小鼠脑中就观察到了明显的血管外纤维蛋白原积累，同时claudin-5和GLUT-1的表达也显著下降，表明血脑屏障功能障碍在阿尔茨海默病病理的早期阶段（Aβ开始积聚时）即已出现。接着，为了深入探究分子机制，研究者从野生型和APP/PS1小鼠脑中分离了富含脑内皮细胞的脑微血管片段。通过蛋白质印迹（Western Blot）和定量PCR（RT-qPCR）分析，他们发现从4月龄开始，APP/PS1小鼠脑微血管中claudin-5、GLUT-1以及紧密连接相关蛋白ZO-1的mRNA和蛋白水平均下降。同时，Wnt/β-catenin通路的关键分子——活化的β-catenin（非磷酸化形式）和抑制性磷酸化形式的GSK3β（p-GSK3β Ser9）水平也显著降低，而Akt通路和Wnt/平面细胞极性（Planar Cell Polarity, PCP）通路的关键蛋白p-Akt和p-VANGL2则无变化。通路下游靶基因Axin2等的mRNA表达也下调。这些结果表明，在阿尔茨海默病模型小鼠的脑内皮细胞中，Wnt/β-catenin通路被特异性抑制，且这种抑制并非通过Akt通路或向Wnt/PCP通路的转换介导。
为了在更可控的系统中验证Aβ的直接作用并阐明机制，研究采用了原代培养的大鼠脑内皮细胞，并用Aβ25-35寡聚体进行处理。Aβ25-35是Aβ的毒性片段，常被用于模拟血脑屏障功能障碍的体外模型。使用20 μM Aβ25-35处理24小时后，脑内皮细胞中claudin-5、ZO-1和GLUT-1的蛋白和/或mRNA表达下降，体外跨内皮通透性实验证实了屏障功能受损。机制上，Aβ处理同样导致了活化的β-catenin和p-GSK3β (Ser9)水平下降，Axin2表达下调，而Akt和VANGL2的活性未受影响。此外，在APP/PS1小鼠和阿尔茨海默病患者脑组织中，Wnt/β-catenin通路的下游转录因子SOX17在血管的表达也降低，进一步支持了该通路在体内被抑制的结论。以上结果共同表明，Aβ寡聚体通过抑制Wnt/β-catenin信号通路（具体表现为GSK3β活性增加导致β-catenin失活），进而损害脑内皮细胞的屏障功能。
研究的核心创新在于干预环节。为了精确调控Wnt/β-catenin通路并评估其治疗潜力，研究团队使用了一种新型的、无需视蛋白（opsin-free）的光遗传学工具来特异性激活该通路的上游共受体LRP6。该工具（称为OptoLRP6）由他们自行开发：通过蓝光照射，诱导光敏蛋白CRY2与CIBN的相互作用，从而将LRP6募集至跨膜蛋白TMEM198附近，模拟Wnt配体激活LRP6的效果，进而可逆地激活下游的Wnt/β-catenin信号。他们将携带OptoLRP6或对照质粒（δCry）的慢病毒感染原代脑内皮细胞，并设置蓝光照射（20分钟开/40分钟关的循环）条件。实验设计分为“救援”和“预防”两种模式。在“救援”模式中，细胞先经Aβ25-35处理24小时诱导损伤，再进行8小时蓝光照射激活OptoLRP6。结果显示，光激活OptoLRP6能显著提升Aβ损伤细胞中Axin2的表达，并恢复claudin-5、ZO-1、GLUT-1的水平，同时改善内皮屏障的通透性。在“预防”模式中，细胞先接受8小时蓝光照射预激活OptoLRP6，随后再暴露于Aβ25-35。结果表明，预激活Wnt/β-catenin通路能有效防止Aβ诱导的上述蛋白表达下降和屏障功能损害。这些体外实验数据均表明，通过靶向激活LRP6来增强Wnt/β-catenin信号，既能挽救已发生的Aβ诱导的内皮细胞损伤，也能起到预防保护作用。
基于以上系统的研究结果，本文得出结论：血脑屏障功能障碍及脑内皮细胞损伤是阿尔茨海默病早期病理事件；其分子机制在于Aβ寡聚体抑制了脑内皮细胞中的Wnt/β-catenin信号通路（通过增加GSK3β活性），导致紧密连接蛋白和GLUT-1表达下调；而利用新型光遗传学工具特异性激活该通路的上游调控因子LRP6，能够有效逆转或预防Aβ诱导的血脑屏障/脑内皮细胞病理改变。因此，靶向脑内皮细胞中的LRP6-Wnt/β-catenin通路，是缓解阿尔茨海默病相关血脑屏障功能障碍的一个极具潜力的治疗新策略。
本研究的科学价值和应用价值重大。在科学上，它清晰地阐明了阿尔茨海默病早期血脑屏障损害的一个具体分子通路机制，将Aβ毒性、Wnt信号失调和内皮功能障碍三者联系起来，丰富了人们对阿尔茨海默病多维度病理机制的理解。在应用上，它首次提出并验证了LRP6作为治疗阿尔茨海默病血脑屏障功能障碍的新靶点，为开发新型药物（例如能够特异性激活内皮细胞LRP6的小分子化合物或生物制剂）提供了明确的靶标和理论依据。同时，研究将纤维蛋白原渗漏与claudin-5/GLUT-1下降相关联，为临床早期诊断阿尔茨海默病血脑屏障损伤提供了潜在的影像学生物标志物思路。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：第一，研究发现的创新性：首次系统揭示了Aβ通过抑制Wnt/β-catenin通路（而非其他Wnt分支或Akt通路）导致脑内皮细胞功能障碍的机制，并明确了LRP6在这一过程中的关键节点作用。第二，研究方法的先进性：创造性地应用了自主研发的“无视蛋白光遗传学”工具（OptoLRP6），实现了对Wnt/β-catenin通路在特定细胞类型（内皮细胞）中高时空精度的可控激活，避免了传统Wnt配体（如Wnt3a）可能激活非靶向通路或细胞类型的弊端，为机制验证和靶点筛选提供了强大工具。第三，研究设计的系统性与严谨性：从人体病理样本到动物模型，从在体组织分析到离体细胞实验，从机制探索到干预验证，研究形成了完整的证据链条。同时，研究不仅关注了疾病发生后的“救援”效果，还前瞻性地验证了“预防”策略的可能性，增强了结论的可靠性和临床应用潜力。第四，临床转化意义明确：研究直接指向了未被满足的临床需求——改善血脑屏障功能，并识别出一个可成药的靶点（LRP6），为阿尔茨海默病的治疗开辟了血管保护这一新方向。
此外，研究中还有一些有价值的细节，例如发现阿尔茨海默病脑内皮细胞中DKK1（通常被认为是Wnt通路抑制因子）的mRNA表达下调，这与在神经元中的报道相反，提示DKK1在不同细胞类型中的调控可能存在差异，这一现象值得后续深入研究。这项研究是一项结合了前沿技术、严谨设计和重要发现的杰出工作，为理解并干预阿尔茨海默病的血管病理环节奠定了坚实基础。