主要作者与机构
本研究由Leon C. D. Smyth、Mike Dragunow等人完成，主要来自新西兰奥克兰大学（University of Auckland）药理与临床药理系、脑研究中心（Centre for Brain Research），以及美国华盛顿大学圣路易斯分校（Washington University in St Louis）脑免疫与胶质中心等机构。该研究于2022年发表在*Communications Biology*期刊上。
研究背景
阿尔茨海默病（Alzheimer‘s disease，AD）中的血管病理学特征已被广泛证实，包括血管密度降低、脑血流量减少和血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）破坏。周细胞（pericyte）是包裹毛细血管并维持BBB的关键细胞类型，其在AD中的丢失是血管病理的核心环节。血小板衍生生长因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）与其受体PDGF受体-β（PDGF receptor-β，PDGFRβ）之间的信号传导对脑周细胞的发育、维持和健康BBB的功能至关重要。在血管系统中，PDGF-BB由内皮细胞特异性分泌，而PDGFRβ在血管壁细胞中富集，尤其在周细胞中表达最高。内皮来源的PDGF-BB被隔离在基底膜中，形成浓度梯度以招募壁细胞至血管，从而促进BBB的形成和稳定。PDGF-B或PDGFRβ缺陷小鼠表现出多种血管表型，包括壁细胞覆盖完全缺失、微动脉瘤形成、出血和BBB形成失败。即使部分缺陷也会导致严重的BBB渗漏、周细胞缺陷和认知障碍。既往研究表明AD中BBB损伤和周细胞丢失已被充分记录，且血管变化发生在淀粉样蛋白沉积等其他病理之前，提示其在AD发病机制中具有因果作用。因此，血管药物靶点是治疗AD的潜在选择。作者假设AD中PDGF-BB:PDGFRβ信号传导受损可能促进血管功能障碍，并着手评估AD中该信号通路组分是否存在缺陷，同时在原代人脑周细胞培养中解析PDGF-BB激活的分子通路及其功能后果。
研究流程与方法
该研究包含多个相互关联的实验环节。首先，研究团队对人类AD脑组织中的PDGF-BB:PDGFRβ信号组分进行了检测。他们使用了分离的原代培养和原位杂交（in situ hybridisation，ISH）确认PDGFB和PDGFRB分别在人脑内皮细胞和周细胞中特异性表达。随后对包含对照和AD核心的组织微阵列（tissue microarray，TMA）进行PDGFRβ免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色，样本量为41-42例；同时利用UEA凝集素标记血管，并结合RNAscope探针检测PDGFB和PDGFRB，样本量为14-28例。此外还分析了来自Mayo Clinic晚发型AD RNA测序项目的颞叶皮层批量RNA测序（bulk RNAseq）数据（80例样本），以及使用NanoString技术对冷冻颞叶皮层组织中PDGFRB表达的检测（9例样本）。
第二，研究者利用原代人脑周细胞进行了体外实验以表征PDGF-BB的响应。周细胞来自癫痫手术切除的颞中回组织或尸检标本。对周细胞进行PDGF-BB（10 ng/ml）处理1小时或24小时后进行RNA测序（RNAseq），分析转录组变化。同时使用磷酸化抗体阵列检测PDGF-BB处理后的关键细胞内通路磷酸化事件，发现ERK和AKT是主要激活的通路。
第三，研究团队通过动力学实验检测了PDGF-BB对PDGFRβ表达、分布和内体（endosome）定位的影响。利用免疫细胞化学、流式细胞术和qPCR，在PDGF-BB刺激后不同时间点（15分钟至24小时）检测PDGFRβ的细胞表面表达、总表达、内化以及PDGFRB基因表达。通过共标记内体标志物EEA1、Rab5、Rab7和溶酶体标志物LAMP1来追踪受体的内化与降解路径。
第四，为了解析ERK和PI3K通路在PDGF-BB响应中的各自贡献，研究者使用药理学抑制剂——PDGFRβ抑制剂sunitinib（100 nM）、PI3K抑制剂wortmannin（100 nM）和MEK/ERK抑制剂U0126（10 μM）——预处理周细胞30分钟，然后加入PDGF-BB处理1小时或24小时，通过qPCR检测基因表达变化。同时通过Western blot验证抑制剂的效力和特异性，检测磷酸化PDGFRβ、ERK和AKT的水平。还检测了PDGF-BB依赖性NF-κB的激活以及EGR-1蛋白的表达。
第五，探究PDGF-BB通过ERK信号对周细胞增殖和凋亡保护的作用。通过Ki67免疫染色、EdU掺入实验和MKI67基因表达检测增殖反应，样本量为3-4个独立实验。使用核包含染料（live/dead）和alamarBlue实验检测细胞活力，以冈田酸（okadaic acid，OA）诱导凋亡，评估PDGF-BB在应激条件下的保护作用及其对ERK和PI3K通路的依赖性。
第六，研究PDGF-BB通过PI3K-NF-κB通路对周细胞分泌谱的影响。通过qPCR检测CCL2、CXCL8、IL6和CX3CL1的基因表达动力学；通过免疫细胞化学和细胞因子微球阵列（cytometric bead array，CBA）检测MCP-1、IL-8、IL-6和CX3CL1的蛋白表达和分泌。还检测了PDGF-BB与IL-1β的协同效应，以及使用siRNA敲低NF-κB p65（siRELA）后对PDGF-BB诱导分泌的影响。
数据分析方面，RNAseq数据处理使用HISAT2、StringTie和Ballgown流程，差异表达基因以FPKM > 8、调整后P值 < 0.05和log2倍数变化 > 2为标准。基因本体分析使用Enrichr，蛋白质网络分析使用STRING。组织染色中的FastRed阳性点使用自定义ImageJ模块计数，内皮细胞PDGFB表达通过与lectin共定位的点数定量，周细胞PDGFRB在扩张的lectin掩模内定量。统计检验采用单因素或双因素方差分析（ANOVA）及Tukey或Dunnett事后检验，显著性标准为P < 0.05。
主要结果
在AD脑组织分析中，IHC未观察到PDGFRβ蛋白丰度的显著变化，但信号较弱。批量RNAseq显示AD中PDGFRB上调而PDGFB无变化；NanoString检测也显示AD中PDGFRB表达上调。然而，ISH结果显示AD中血管相关PDGFB显著减少，而血管相关PDGFRB增加，与RNAseq数据一致。这些结果表明AD中存在PDGF-BB:PDGFRβ信号通路的改变，可能促进血管病理。
在PDGF-BB体外响应方面，RNAseq显示PDGF-BB处理1小时和24小时呈现不同的基因特征。急性响应（1小时）包括立即早期基因（immediate early genes，IEG）EGR1、KLF2、KLF4、JUN、FOS和ATF3的诱导，以及编码分泌蛋白的基因IL6和CXCL8的诱导。24小时后，IEG恢复至基线，而MMP1、IL1RL1和TP53被诱导，CX3CL1、ACTA2、TAGLN和GPR176被强烈抑制。基因本体分析提示PDGF-BB信号调控血管生成和愈合过程以及增殖，交互枢纽围绕MAPK1、RELA和JUN。交叉参照Vanlandewijck等人的周细胞和血管平滑肌细胞（VSMC）谱系转录本表明，24小时PDGF-BB处理导致周细胞转录本的富集和VSMC谱系标志物的耗竭。磷酸化筛选检测到ERK和AKT是主要的激活通路。
PDGFRβ动力学实验显示，PDGF-BB刺激后1小时内PDGFRβ点状形成增加，随后在4至24小时出现明显降解，之后有再合成。PDGFRB基因表达在24小时最显著下降。流式细胞术确认受体在刺激后15分钟内快速内化，随后总PDGFRβ信号丧失。内化后，PDGFRβ与EEA1/Rab5/Rab7阳性内体共定位，随后进入LAMP1阳性溶酶体，表明受体经内吞-溶酶体途径降解。
通路解析实验显示，CXCL8、CCL2、CX3CL1和IL6的早期诱导以及MMP1的晚期诱导均被wortmannin阻断，表明依赖PI3K信号。相比之下，仅24小时CX3CL1的抑制依赖ERK。Sunitinib和U0126能阻断PDGF-BB诱导的ERK磷酸化，并降低EGR-1蛋白水平。NF-κB在PDGF-BB响应早期有轻微诱导，且此效应依赖PI3K。ATF3和c-Jun的完全激活需要ERK和AKT两者，但未观察到STAT1、STAT3或SMAD2/3的激活。
功能实验表明，PDGF-BB诱导强烈的增殖反应（Ki67和EdU阳性核增加、MKI67表达升高），此效应被sunitinib和U0126阻断，但不被wortmannin阻断，表明增殖由PDGFRβ-ERK信号控制。在OA诱导的凋亡模型中，PDGF-BB保护周细胞免于凋亡，且此保护作用被sunitinib和U0126阻断，而非wortmannin，表明PDGF-BB通过ERK通路在应激条件下促进周细胞存活。
分泌谱分析显示，CCL2、CXCL8、IL6和CX3CL1的表达在刺激后1小时达到峰值，其中CX3CL1在24小时被强烈抑制。MCP-1染色在刺激后2小时达到峰值，MCP-1、IL-8和IL-6的分泌在8小时内检测到增加，而CX3CL1分泌在至少48小时的PDGF-BB处理后受到抑制。PDGF-BB与IL-1β在诱导MCP-1和IL-6表达方面存在协同效应，且PDGF-BB即使被IL-1β诱导也能将CX3CL1分泌抑制至基线水平。MCP-1、IL-8和IL-6的诱导依赖AKT，而CX3CL1的抑制依赖ERK。NF-κB p65敲低减弱了MCP-1、IL-6和IL-8的诱导，但不改变CX3CL1的抑制。
结论与意义
该研究首次在分子和功能水平上表征了原代人脑周细胞中PDGFRβ信号传导的后果。研究证实AD中血管PDGF-BB:PDGFRβ信号组分发生改变，特别是内皮PDGFB表达的显著丢失。在体外，PDGF-BB通过ERK通路促进周细胞增殖和应激条件下的存活，而通过PI3K-NF-κB通路增强周细胞来源的炎症分泌。这些发现提示，在AD的毒性环境中，PDGF-BB信号不足可能导致周细胞无法更新且更易死亡；同时，PDGF-BB水平的降低可能减少周细胞的构成性营养因子分泌，使内皮细胞对AD相关应激源造成的损伤更敏感。该研究提出了通过补充PDGF-BB信号或使用PDGFRβ激动剂来稳定AD脑血管系统的可能性，为AD的血管靶向治疗提供了潜在策略。
研究亮点
该研究的创新之处在于：第一，首次在原代人脑周细胞中系统性地将PDGFRβ信号传导的分子通路与功能后果联系起来，明确区分了ERK和AKT通路的不同作用——ERK介导增殖和存活保护，而AKT介导炎症分泌增强。第二，利用ISH克服了批量RNAseq无法区分细胞类型变化的局限，揭示了AD中血管相关PDGFB的减少和PDGFRB的增加这一关键发现。第三，结合RNAseq、磷酸化筛选、药理学抑制、流式细胞术和多种功能实验，构建了从基因表达、信号转导到细胞功能的完整证据链，为理解AD中周细胞功能障碍的分子机制奠定了基础。
其他有价值的发现
研究还观察到PDGF-BB可诱导KLF2和KLF4，进而降低VSMC表型标志物（ACTA2、TAGLN、MYH11）的表达，提示PDGF-BB信号可能参与周细胞表型的维持。此外，近期单细胞RNAseq数据表明AD脑中微胶质细胞PDGFB表达大幅增加，提示局部血管周围PDGF-BB浓度分布的破坏可能在AD血管病理中发挥重要作用，而不仅仅取决于整体PDGF-BB水平。PDGFRβ RNA与蛋白表达的不一致可能是由于AD相关炎症介质（如干扰素-γ）诱导PDGFRβ表达但阻断其再合成所致。这些发现拓展了对AD神经血管单元中PDGF-BB:PDGFRβ信号失调机制的理解。