本研究的主要作者是D.S. Thommen和A. Zippelius，分别来自瑞士巴塞尔大学医院生物医学系癌症免疫学团队以及荷兰癌症研究所分子肿瘤学与免疫学分部，研究由这两所机构的科学家共同领导。本论文发表于《Nature Medicine》期刊，时间为2018年7月，卷期号为24(7): 994–1004，DOI: 10.1038/s41591-018-0057-z。
该研究的学术领域属于肿瘤免疫学，具体聚焦于T细胞耗竭（T cell exhaustion）与免疫检查点阻断治疗的机制研究。研究背景源于慢性病毒感染模型中的发现：根据程序性死亡受体-1（PD-1）表达水平的不同，耗竭的CD8+ T细胞亚群在功能和再激活潜力上存在差异。然而，在人类癌症中，T细胞是否也存在基于PD-1表达水平的类似功能谱系尚不清楚。此外，尽管PD-1/PD-L1阻断疗法在非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）等癌症中显示出疗效，但并非所有PD-1+ T细胞都能同等程度地被重新激活，因此需要更精确地理解肿瘤内不同PD-1表达水平的T细胞亚群的功能状态及其与治疗反应的关系。基于此，本研究旨在：1）验证在人类NSCLC中，不同PD-1表达水平的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）是否代表了不同的细胞状态；2）比较人类癌症中PD-1高表达（下文称PD-1t）T细胞与慢性病毒感染模型中耗竭T细胞的异同；3）确定肿瘤反应性（即识别肿瘤细胞的能力）在不同PD-1+ TIL亚群中的分布情况。
研究的详细工作流程包含多个相互关联的环节，研究对象主要来自接受手术或治疗的NSCLC患者的新鲜或石蜡包埋肿瘤组织样本。研究首先基于流式细胞术，根据PD-1的表达强度，将肿瘤内CD8+ TILs分为三个亚群：无PD-1表达的PD-1-、表达水平与健康供体外周血T细胞相似的PD-1n、以及表达水平显著高于健康供体水平的PD-1t。为了准确定义PD-1t，研究人员对比了来自24例NSCC标本的TILs与6名健康供体外周血T细胞的PD-1表达谱，确定了“肿瘤相关”高表达的标准。在样本处理上，新鲜肿瘤组织通过机械和酶解消化制成单细胞悬液并冻存。研究的核心流程如下：
第一步：表型、功能与肿瘤反应性表征。 研究者首先分析了24个NSCLC样本中，不同PD-1亚群上其他抑制性受体（TIM-3, LAG-3, TIGIT, 2B4, BTLA）的表达情况，发现其表达水平与PD-1水平呈正相关。接着，对来自3个样本的分选后PD-1亚群进行体外多克隆刺激（anti-CD3/anti-CD28），通过微珠免疫分析法评估其分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ的能力。同时，为了探究这些亚群的克隆性和肿瘤反应性，研究进行了T细胞受体（TCR）测序分析（来自11个样本的RNA测序数据），并设计了一套体外扩增与共培养实验。具体而言，从8个肿瘤样本中分选出PD-1t、PD-1n和PD-1-细胞，使用经辐照的同种异体外周血单个核细胞（PBMCs）作为饲养层细胞，并在高剂量IL-2和抗CD3抗体存在下进行为期约15天的扩增。扩增后，将这些T细胞与自体的肿瘤组织消化物进行共培养，通过检测IFN-γ的产生来评估其肿瘤反应性，并使用HLA-I类抗体阻断实验验证反应的特异性。
第二步：转录组与代谢谱分析。 为了在分子层面深入理解PD-1t细胞的特性，研究团队对从11个NSCLC样本中分选的三个PD-1亚群以及健康供体的外周血效应记忆T细胞进行了RNA测序（RNA-seq）。数据分析采用主成分分析、差异表达基因筛选、层次聚类分析和基因集富集分析等方法。基因本体论分析用于识别生物学通路的变化。此外，研究特别将PD-1t细胞的基因特征与已发表的慢性病毒感染（如LCMV）和癌症模型中的“耗竭”基因特征集进行了比较。同时，为了探究功能缺陷的代谢基础，研究人员利用流式细胞术结合多种代谢荧光染料，对新鲜或冻存的肿瘤消化物中不同PD-1亚群的代谢状态进行了检测，包括葡萄糖摄取（2-NBDG）、脂质含量与摄取（Bodipy染料）、线粒体质量（Mitotracker Green）和膜电位（Mitotracker Red）。还通过透射电子显微镜对分选的PD-1t和PD-1n细胞的线粒体超微结构进行了成像分析。
第三步：功能可塑性与环境敏感性的研究。 基于体外扩增后PD-1t细胞功能可恢复但某些抑制性受体仍高表达的观察，研究探索了其潜在的固有功能障碍状态。研究者分析了白细胞介素-10（IL-10）信号通路，检测了肿瘤微环境中IL-10的来源，并进一步设计了功能实验：将经过IL-2扩增的TIL亚群再次暴露于IL-10环境中，观察其对PD-1再表达和IFN-γ产生能力的影响，同时检测了IL-10受体和下游效应分子穿孔素的变化。
第四步：新型效应功能探索与临床预测价值验证。 转录组分析揭示PD-1t细胞高表达趋化因子CXCL13。研究通过体外检测分选细胞的上清液验证了其蛋白分泌。为了探究其功能，研究者从患者外周血中分选出表达CXCR5（CXCL13的受体）的CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和B细胞，在Transwell系统中测试它们对重组CXCL13的趋化反应。接着，通过多重免疫组织化学染色和数字化图像分析，在组织切片上定位PD-1t细胞（使用CD8/PD-1双染），并分析它们与滤泡辅助性T细胞和B细胞在三级淋巴结构中的空间关系。最后，也是本研究的关键转化应用部分，研究人员开发并验证了一种基于免疫组化和数字化图像分析的算法，用于在石蜡包埋组织中定量PD-1t细胞。他们将此方法应用于21例接受抗PD-1治疗（纳武利尤单抗）的IV期NSCLC患者的治疗前活检样本，评估PD-1t细胞浸润程度与治疗客观反应、无进展生存期和总生存期的相关性。
本研究获得了一系列重要结果，环环相扣，逐步揭示了PD-1t细胞的独特性质及其临床意义。首先，表型与功能分析 证实，PD-1t细胞共表达多种其他抑制性受体，并且在直接离体状态下，经刺激后几乎不能产生经典的效应细胞因子（IL-2, TNF-α, IFN-γ），表现出深度功能耗竭。然而，TCR分析 显示PD-1t细胞具有极高的克隆性，前30个克隆占据其总TCR库的近90%，且这些优势克隆在PD-1n和PD-1-亚群中丰度极低。这提示PD-1t细胞的扩增可能由强烈的抗原驱动，而非从PD-1n到PD-1t的渐进性耗竭过渡。肿瘤反应性实验 结果极具说服力：在8例患者中，有7例的肿瘤反应性高度富集（6例）或完全局限于（1例）从PD-1t细胞扩增而来的群体中。这表明肿瘤内绝大多数具有抗肿瘤潜能的T细胞都存在于PD-1t亚群内。
转录组分析结果 是本研究的关键转折点。主成分分析显示，PD-1t细胞的基因表达谱与PD-1n和PD-1-细胞存在显著差异，而后两者则高度相似。与慢性感染模型中的耗竭T细胞不同，PD-1t细胞中与细胞周期和增殖相关的基因显著上调，蛋白水平的Ki67表达和细胞周期分析也证实了其具有持续的增殖能力。基因集富集分析进一步表明，PD-1t细胞的基因特征与慢性病毒感染或小鼠早期/晚期肿瘤模型中的经典“耗竭”特征集并不特别相似，反而与人类肝癌单细胞测序鉴定的耗竭CD8+ TILs特征更接近。这强有力地证明了PD-1t细胞在人类肺癌中代表了一种独特的、不同于以往认知的耗竭状态。
代谢分析结果 为此提供了另一维度证据：PD-1t细胞表现出葡萄糖摄取和脂质代谢显著增强，但同时伴有线粒体功能严重失调——线粒体膜电位降低，电镜显示其线粒体数量虽多但嵴减少、结构异常。这种“高耗能但低效产能”的代谢状态可能加剧了其功能缺陷。
关于功能可塑性，研究发现PD-1t细胞在体外IL-2支持下扩增后，PD-1表达下降并恢复效应功能，但某些抑制性受体（如TIM-3, LAG-3）仍维持较高表达。更重要的是，当再次暴露于肿瘤微环境中常见的免疫抑制因子IL-10时，PD-1t来源的细胞会迅速重新高表达PD-1，并且IFN-γ生产能力受到更严重的抑制，而PD-1n和PD-1-来源的细胞对此不敏感。这表明PD-1t细胞存在一种固有的、对环境抑制信号高度敏感的功能障碍设定。
研究最引人注目的发现之一是PD-1t细胞的新型效应功能。转录组和蛋白检测均证实其高表达并分泌趋化因子CXCL13。体外趋化实验证明CXCL13能有效招募表达CXCR5的CD4+ T细胞和B细胞。组织定位分析则显示，PD-1t细胞并非随机分布，而是高度富集于肿瘤内及瘤周的三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures, TLS） 中，通常位于B细胞区域外围和肿瘤-宿主交界处，与滤泡辅助性T细胞和B细胞紧密相邻。这表明PD-1t细胞可能通过分泌CXCL13，主动参与募集和塑造肿瘤内的免疫细胞群落，从而获得了一种超越直接杀伤的“组织者”功能。
最终，临床相关性分析 将基础发现与临床应用直接联系。在21例接受抗PD-1治疗的NSCLC患者队列中，治疗前活检组织中PD-1t TILs的存在，与治疗客观反应呈现出极强的正相关性。生存分析显示，PD-1t细胞阳性患者的无进展生存期和总生存期均显著延长。相比之下，PD-1n细胞的预测价值较低。这确证了PD-1t细胞作为预测PD-1阻断疗法疗效的新型潜在生物标志物。
本研究得出核心结论：在人类非小细胞肺癌中，存在一个转录、代谢和功能上均与众不同的PD-1高表达（PD-1t）CD8+ T细胞亚群。该亚群虽然表现出经典效应细胞因子分泌缺陷，但具有高度的克隆扩增、持续的增殖能力、独特的代谢重编程、以及对肿瘤抗原的高内在反应性。尤为重要的是，它们获得了一种分泌CXCL13、参与形成三级淋巴结构的新型功能。这种细胞状态与慢性病毒感染模型中描述的耗竭状态存在显著区别，代表了人类癌症中一种独特的T细胞功能障碍范式。本研究最重要的价值在于，它不仅深化了对肿瘤免疫微环境中T细胞功能异质性的科学理解，更重要的是，将PD-1t细胞的丰度确立为一个极具潜力的预测性生物标志物，为临床上筛选可能从PD-1/PD-L1阻断疗法中获益的NSCLC患者提供了新工具。此外，研究揭示的PD-1t细胞上大量共表达的抑制性受体，也为开发联合免疫疗法（如同时靶向PD-1和其他检查点）以进一步逆转其功能障碍提供了新的治疗靶点。
本研究的亮点在于：第一，重要的科学发现：明确鉴定并系统表征了人类NSCLC中一个功能独特、富含肿瘤反应性且具有预测价值的PD-1t T细胞亚群，挑战并拓展了基于小鼠模型的经典T细胞耗竭理论。第二，研究方法的系统性与创新性：研究整合了多组学分析（转录组、TCR组）、深度代谢表征、高分辨率显微成像、功能性体外共培养与趋化实验，以及基于数字化病理的临床生物标志物开发，形成了从机制探索到临床验证的完整证据链。其中，将流式细胞术定义的PD-1t表型转化为可应用于常规石蜡切片免疫组化的定量算法，是一项关键的方法学创新，极大地提升了发现的临床转化潜力。第三，研究逻辑的严谨性：研究设计环环相扣，从现象描述（表型差异）到机制探索（转录、代谢、功能可塑性），再到功能验证（肿瘤反应性、CXCL13作用）和临床意义确认（预测价值），每一步结果都为下一步假设提供了依据，最终汇聚成一个强有力的科学叙事。