基于金属-槲皮素-组氨酸协同配位纳米颗粒的癌症光热疗法通过重塑免疫抑制性肿瘤微环境实现增强治疗
一、 研究作者、机构与发表信息
本研究由Shaobo Wang (a,b)、Shuncheng Yao (b,c)、Quanhong Hu (a,b)、Zhuo Wang (b)、Yunchao Zhao (b,d) 和通讯作者 Linlin Li (a,b,c,*）共同完成。作者单位包括：广西大学物理科学与技术学院、纳米能源研究中心、广西高校蓝色能源与系统集成重点实验室、碳达峰碳中和科学技术研究院 (a)；中国科学院北京纳米能源与系统研究所、北京纳米能源与系统研究所高熵能源与系统中心、北京市微纳能源与传感重点实验室 (b)；中国科学院大学纳米科学与工程学院 ©；山东农业大学化学与材料科学学院 (d)。该研究成果发表于国际知名期刊 Chemical Engineering Journal，于2024年9月20日在线发表，卷期号为 Chemical Engineering Journal 499 (2024) 156027。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于纳米医学、肿瘤治疗学和免疫治疗学的交叉领域，聚焦于光热疗法（Photothermal Therapy, PTT） 的增效与副作用克服问题。PTT作为一种利用光热转换剂（PCAs）将光能转化为局部热量以消融肿瘤的高效局部治疗方法，具有选择性高、毒副作用低、治疗快速等优点，并已进入临床前试验阶段。然而，传统PTT存在一个关键瓶颈：治疗过程中产生的过度热量会刺激肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）产生大量活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）和促炎反应，这无意中加剧了肿瘤的免疫逃逸、复发和转移风险。尽管PTT本身可以诱导免疫原性细胞死亡（Immunogenic Cell Death, ICD），释放肿瘤相关抗原，但这种效应通常不足以逆转免疫抑制性的TME，难以将“冷”肿瘤（免疫细胞浸润少）转化为“热”肿瘤（免疫细胞浸润多）。
另一方面，免疫检查点抑制剂（Immune-Checkpoint Inhibitors, ICIs，如抗PD-1/PD-L1抗体）在癌症免疫治疗中取得了革命性进展，但其响应率有限，且常伴随免疫相关不良反应。与此同时，天然抗氧化剂如槲皮素（Quercetin, Que） 因其卓越的清除ROS、抗炎和免疫调节能力（包括干扰PD-1/PD-L1相互作用）而备受关注，但其水溶性差严重限制了其应用。
因此，本研究旨在解决上述双重挑战。研究团队设计并构建了一种多功能纳米平台——金属-槲皮素-组氨酸协同配位纳米颗粒（Fe²⁺-Quercetin-Histidine co-coordinated nanoparticles, FQH NPs）。该研究的主要目标是：1）开发一种具有高效光热转换性能的新型PCA；2）赋予该PCA在PTT后清除过量ROS、调节炎症的能力；3）进一步使其能够下调肿瘤细胞PD-L1表达，从而协同PTT诱导的ICD效应，共同重塑免疫抑制性TME，激活抗肿瘤免疫，最终实现抑制原发肿瘤生长、防止远端转移并建立免疫记忆的全面治疗效果。
三、 详细研究流程与方法
本研究流程严谨，从材料设计合成、理化性质表征、体外功能验证到体内疗效评估，环环相扣。
1. FQH NPs的制备与表征 * 研究对象与制备方法：研究通过简单的室温自组装法合成FQH NPs。将氯化亚铁（FeCl₂）水溶液与槲皮素（Que）甲醇溶液混合后，滴加组氨酸（Histidine, His）水溶液，搅拌后离心洗涤得到纳米颗粒。通过调整His与Fe²⁺的摩尔比，制备了不同配比的纳米颗粒（FQ NPs，无His；FQH NPs-2/4/8）。 * 实验方法与分析： * 形貌与结构：使用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察纳米颗粒的形貌和尺寸（约75 nm）。通过能量色散X射线光谱（EDS）元素映射分析确认Fe、C、O、N元素的均匀分布。 * 化学结构与配位：采用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析官能团变化，证实了Que的儿茶酚基团和His的羰基、甲亚胺基团与Fe²⁺的配位。X射线衍射（XRD）图谱显示自组装后材料呈非晶态。X射线光电子能谱（XPS）证实了Fe主要以+2价态存在。 * 光学与降解性能：紫外-可见吸收光谱（UV-Vis）显示，随着His加入，吸收峰红移并拓宽至近红外区，这归因于配体到金属的电荷转移（Ligand-to-Metal Charge Transfer, LMCT），为高效光热转换奠定了基础。研究了FQH NPs在不同pH下的降解行为及Que的释放曲线，证明其在酸性TME中可降解并持续释放Que。 * 光热性能：使用808 nm近红外激光照射不同浓度的FQH NPs水溶液，用红外热成像仪监测温度变化，计算光热转换效率（η）。FQH NPs的η高达40.7%，显著高于单独的Que（6.9%）和不含His的FQ NPs（17.2%），且经过四个激光开关循环后性能稳定。 * 抗氧化性能：通过DPPH自由基清除实验和羟基自由基（•OH）清除实验（采用水杨酸捕获法）评估FQH NPs的ROS清除能力。结果表明，FQH NPs具有优异的自由基清除能力。
2. 体外细胞水平研究 * 研究对象：小鼠乳腺癌细胞4T1（作为肿瘤模型）和小鼠成纤维细胞L929（作为正常细胞模型用于生物安全性评估）。 * 实验流程： * 细胞毒性：采用MTT法评估FQH NPs的细胞毒性。分别测试了FQH NPs在有/无近红外激光照射下对4T1细胞和L929细胞的杀伤效果。激光参数为808 nm，0.75 W cm⁻²，照射3分钟。 * 细胞内ROS检测：使用DCFH-DA和DHE荧光探针，通过激光共聚焦显微镜观察并定量分析经不同处理（对照组、激光组、Que组、Que+激光组、FQH NPs组、FQH NPs+激光组）后4T1细胞内的ROS水平。 * 免疫原性细胞死亡（ICD）标志物检测：通过免疫荧光染色，检测经不同处理后4T1细胞表面钙网蛋白（Calreticulin, CRT）的暴露情况，这是ICD的关键标志之一。 * 抗炎作用评估：使用脂多糖（LPS）刺激RAW264.7巨噬细胞，模拟促炎型TME。然后将经FQH NPs处理的4T1细胞的条件培养基与这些巨噬细胞共培养，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测巨噬细胞分泌的促炎因子白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。 * PD-L1表达下调：通过蛋白质印迹法（Western Blot）分析经FQH NPs处理后4T1细胞中PD-L1的蛋白表达水平。
3. 体内动物实验研究 * 动物模型：使用雌性BALB/c小鼠建立原位4T1乳腺癌模型（将细胞注射到左侧乳腺脂肪垫）。 * 实验分组与治疗：当肿瘤体积达到约100 mm³时，将荷瘤小鼠随机分为6组（n=5）：1) 生理盐水组；2) 仅激光组；3) Que组；4) Que+激光组；5) FQH NPs组；6) FQH NPs+激光组。通过瘤内注射给药（剂量为5 mg kg⁻¹），注射12小时后，对激光组进行局部808 nm激光照射（0.75 W cm⁻²，3分钟）。监测肿瘤体积、小鼠体重变化。 * 疗效与机制分析： * 肿瘤抑制与转移评估：治疗结束后，处死小鼠，剥离肿瘤称重，计算抑瘤率。对肿瘤组织进行H&E染色和Ki-67免疫组化染色，分析细胞凋亡/坏死和增殖情况。对主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）进行H&E染色，评估全身毒性，并特别检查肝脏和肺部是否有转移灶。通过免疫组化染色检测肝脏中肿瘤干细胞标志物CD44的表达，进一步评估转移抑制情况。 * 免疫微环境分析：另设一组实验（n=3/组），在治疗后第2天收集肿瘤组织，制备单细胞悬液，通过流式细胞术分析肿瘤内免疫细胞浸润情况，包括成熟树突状细胞（CD11c+CD80+CD86+）、CD4+ T细胞（CD3+CD4+CD8-）和CD8+ T细胞（CD3+CD4-CD8+）的比例。同时，通过Western Blot检测肿瘤组织中CRT和PD-L1的蛋白表达。 * 免疫记忆效应评估：建立双侧肿瘤模型以模拟转移和评估免疫记忆。先在小鼠左侧建立原发性肿瘤，进行上述四种处理（生理盐水、激光、FQH NPs、FQH NPs+激光）。治疗8天后，在同一只小鼠的右侧乳腺脂肪垫再次注射4T1细胞（模拟远端肿瘤），不进行额外治疗，持续观察双侧肿瘤的生长情况和小鼠生存期。最终分析肺和肝组织的转移情况。
四、 主要研究结果及其逻辑关联
1. FQH NPs的成功构建与优异性能：研究成功合成了形貌均一、尺寸约75 nm的FQH NPs。关键发现是，组氨酸（His）的引入通过其咪唑基团作为σ-供体和π-受体，显著增强了Fe²⁺与槲皮素（Que）酚羟基之间的配位作用，形成了更稳定的共配位结构。这不仅将Que的负载率从无His时的16.6%提高到46.6%，更重要的是通过LMCT效应，使材料的光吸收拓展至近红外区，从而获得了高达40.7%的光热转换效率，为高效PTT提供了物理基础。同时，FQH NPs继承了Que的强抗氧化能力，能有效清除DPPH和•OH自由基。
2. 体外协同治疗与免疫调节效果：MTT实验表明，FQH NPs对正常细胞L929毒性低，而对4T1癌细胞具有选择性毒性，结合近红外激光照射后，对癌细胞的杀伤效果显著增强（存活率降至12%）。激光共聚焦结果显示，FQH NPs能有效清除PTT过程中细胞内产生的过量ROS。这为后续调节炎症反应奠定了基础。进一步的机制研究表明：1) FQH NPs联合激光处理能显著诱导4T1细胞发生ICD，表现为细胞膜CRT暴露增加；2) FQH NPs能下调4T1细胞PD-L1的表达（降低约53%）；3) 经FQH NPs处理的癌细胞条件培养基能显著抑制被LPS激活的巨噬细胞分泌促炎因子IL-6和TNF-α。这些结果在逻辑上串联起来表明：FQH NPs不仅通过光热作用直接杀死癌细胞，还能通过清除ROS减轻PTT引发的有害炎症，并通过下调PD-L1来解除对T细胞的抑制，为在体内激活抗肿瘤免疫创造了有利条件。
3. 体内卓越的抗肿瘤及抗转移疗效：在小鼠原位4T1乳腺癌模型中，FQH NPs + 激光组表现出最强的光热升温效果（局部达57.4°C）和最显著的肿瘤生长抑制（抑瘤率98.19%，5只小鼠中有3只肿瘤完全消除）。组织学分析显示该组肿瘤细胞凋亡坏死最严重，增殖标志物Ki-67表达最低。更重要的是，与其他各组在肝脏出现不同程度转移结节相比，FQH NPs + 激光组小鼠的肝脏未见转移结节，且肝脏中肿瘤干细胞标志物CD44的表达也最低，证明了其强大的抑制转移能力。
4. 免疫微环境重塑与免疫记忆的证实：流式细胞术分析显示，FQH NPs + 激光组肿瘤中成熟树突状细胞（DCs）比例、CD4+和CD8+ T细胞浸润比例均显著高于其他组。Western Blot证实该组肿瘤组织内PD-L1表达下调了约50%。这直接验证了体外发现的免疫调节机制在体内同样有效：PTT诱导的ICD提供了抗原，DCs被激活并提呈抗原，同时PD-L1的下调解除了对T细胞的刹车，共同导致T细胞大量浸润和活化。在双侧肿瘤模型中，FQH NPs + 激光治疗不仅清除了原发性肿瘤，还能有效抑制再次接种的远端肿瘤的生长，且小鼠长期存活率（40天时100%存活）远高于其他组。肺和肝组织病理学检查显示，该组几乎完全阻止了肿瘤的远端转移。这强有力地证明了该治疗策略成功激发了系统性的抗肿瘤免疫记忆效应，能够防止肿瘤复发和转移。
五、 研究结论与价值
本研究成功设计并构建了一种新型的金属-槲皮素-组氨酸协同配位纳米颗粒（FQH NPs）。该纳米颗粒不仅作为一种高效的光热转换剂，提升了PTT的直接杀伤效果，更是一个多功能免疫调节平台。其核心价值在于通过单一纳米体系，同步解决了PTT后ROS/炎症风暴加剧免疫抑制、以及肿瘤免疫检查点分子高表达两大关键问题。
科学价值：1) 提出了一种通过氨基酸（组氨酸）协同配位策略增强天然活性分子（槲皮素）负载与功能（光热性能）的材料设计新思路。2) 阐明了“光热治疗-ROS清除-免疫检查点下调”多机制协同重塑免疫抑制性肿瘤微环境、并将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的完整作用路径，为发展新型免疫协同抗肿瘤策略提供了重要的理论依据和实验证据。
应用价值：为克服传统PTT易导致肿瘤复发和转移的临床难题提供了一种有前景的解决方案。FQH NPs基于生物相容性良好的组分（铁离子、槲皮素、组氨酸）构建，体内外均显示出良好的安全性，具备临床转化的潜力。该策略有望拓展至其他癌症的治疗中。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
本研究还详细评估了FQH NPs的生物相容性。体外溶血实验表明高浓度FQH NPs不引起溶血；体内静脉注射高剂量FQH NPs后，小鼠体重、血常规、血液生化指标及主要脏器病理切片均未发现明显异常，证明了其良好的体内安全性。这为其进一步的生物医学应用奠定了重要基础。此外，研究中对纳米颗粒在不同pH下降解行为的考察，也体现了其作为智能药物递送系统的潜力，能够在酸性的肿瘤微环境中特异性释放活性成分。