关于肿瘤来源外泌体通过PD1-HK2-GLUT1代谢轴调控免疫细胞代谢重组的研究报告

一、 研究团队与论文发表信息

本研究的主要作者包括Nazanin Joudaki，并得到了来自伊朗阿瓦士Jundishapur医科大学（Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences）相关团队的支持。该研究已发表于学术期刊《组织与细胞》（*Tissue and Cell*）2021年第71卷，文章编号为101576。

二、 研究背景与目的

本研究的核心科学领域是肿瘤免疫学与细胞代谢的交叉领域，具体聚焦于肿瘤微环境中细胞间通讯的重要介质——外泌体（exosomes）对免疫细胞功能的重编程作用。

科学背景： 越来越多的证据表明，肿瘤细胞能够通过释放外泌体这一囊泡状细胞外载体，向周围及远端的细胞传递蛋白质、脂质、核酸（如microRNA）等生物活性分子，从而重塑肿瘤微环境，促进肿瘤的进展、转移和免疫逃逸。其中，肿瘤来源外泌体对免疫细胞，特别是肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）功能的抑制，是肿瘤实现免疫逃逸的关键机制之一。近年来，代谢重编程被确认为T细胞功能状态（如活化、耗竭、记忆形成）的核心决定因素。活化的效应T细胞主要依赖糖酵解（glycolysis）快速产生能量和生物大分子前体，而耗竭T细胞或调节性T细胞则表现出线粒体氧化磷酸化受损和代谢能力低下的特征。

PD-1（程序性死亡蛋白1）是T细胞上重要的免疫检查点分子，其与配体PD-L1结合后，会向T细胞内传递抑制性信号，不仅直接抑制T细胞的增殖与细胞因子分泌，还被证明能够通过抑制糖酵解关键酶己糖激酶2（HK2）和葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）的表达，来改变T细胞的代谢程序，使其从高效的糖酵解状态转向低效的脂肪酸氧化，从而导致T细胞功能衰竭。

研究动机与目的： 基于以上背景，本研究提出了一个科学假设：乳腺癌细胞是否可能通过释放外泌体，将能够重编程免疫细胞代谢的信号传递给外周血单个核细胞（PBMCs），特别是通过影响PD1-HK2-GLUT1这一代谢调控轴？为了验证这一假设，研究团队旨在探究：1）乳腺癌细胞系（MDA-MB-231）来源的外泌体，以及2）乳腺癌患者血清来源的外泌体，对健康人PBMCs中 *PD1*、*HK2*、GLUT1 基因表达的影响，从而揭示外泌体在调控免疫细胞糖酵解代谢通路中的作用。

三、 详细研究流程与方法

本研究包含外泌体制备与表征、免疫细胞处理以及基因表达分析三个主要部分，流程设计严谨，对照明确。

第一部分：外泌体的分离与鉴定 1. 外泌体来源： * 细胞来源外泌体：使用三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行培养，收集其上清液。 * 血清来源外泌体：招募10名处于III-IV期的浸润性导管癌乳腺癌患者（患者 demographic 数据见表1），采集其外周血血清样本。同时，研究获得了所有参与者的书面知情同意。 2. 外泌体分离：使用商业化的外泌体提取试剂盒，分别从细胞培养上清和患者血清中分离纯化外泌体。 3. 外泌体鉴定：这是确保后续实验所用材料确为外泌体的关键步骤，采用了两种物理学方法： * 动态光散射（DLS）：测量外泌体颗粒的流体动力学直径。结果显示，MDA-MB-231细胞系来源的外泌体，90%的颗粒直径约为89.6纳米；乳腺癌患者血清来源的外泌体，90%的颗粒直径约为77.7纳米。这符合外泌体直径通常在40-200纳米范围内的特征。 * 原子力显微镜（AFM）：直接观察外泌体的形貌和大小。图像清晰显示，两种来源的外泌体均呈典型的茶托状或球形结构，直径范围在40-200纳米之间，与DLS结果相互印证。 * 蛋白质浓度测定：使用BCA蛋白定量法测定外泌体悬液的蛋白浓度，以标准化后续处理细胞的用量。

第二部分：免疫细胞的分离与外泌体处理 1. PBMCs分离：从健康献血者的EDTA抗凝外周血中，使用Ficoll密度梯度离心法分离出外周血单个核细胞（PBMCs），主要包括淋巴细胞和单核细胞。 2. 细胞培养与处理：将分离的PBMCs接种于24孔板中，每孔接种1x10^6个细胞，使用RPMI-1640培养基培养。 * 实验组A：用浓度为100 μg/mL的MDA-MB-231细胞系来源外泌体处理PBMCs。 * 实验组B：用浓度为100 μg/mL的乳腺癌患者血清来源外泌体处理PBMCs。 * 对照组：PBMCs不经外泌体处理，仅用培养基培养。 * 所有组别均在37°C、5% CO2的培养箱中处理72小时。

第三部分：基因表达分析与数据处理 1. RNA提取与cDNA合成：处理72小时后，收集各组细胞，使用RNeasy Mini Kit提取总RNA。随后，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，以随机六聚体引物将RNA反转录为cDNA。 2. 实时定量PCR（qRT-PCR）：这是本研究检测基因表达水平的核心实验。 * 目标基因：*PD1*、*HK2*、*GLUT1*。 * 内参基因：*ACTB*（β -肌动蛋白），用于归一化目标基因的表达量，消除样本间RNA投入量和反转录效率的差异。 * 引物设计：所有引物均设计在基因的外显子区域，以降低基因组DNA污染的风险。使用Gene Blast软件验证引物特异性（引物序列见表2）。 * 反应与检测：使用SYBR Green荧光染料法在Applied Biosystems Step One实时PCR仪上进行。使用LinRegPCR软件分析引物扩增效率（表3显示所有引物效率在1.85-1.89之间，符合要求），并通过熔解曲线分析确认扩增产物的特异性。 3. 数据分析：采用2^-ΔΔCt 相对定量法计算目的基因相对于对照组的变化倍数。使用GraphPad Prism 8软件，采用单向方差分析（one-way ANOVA）进行统计学显著性检验，显著性水平设定为p < 0.0001。

四、 主要研究结果

研究结果清晰地展示了不同来源的外泌体对PBMCs代谢相关基因表达的差异化影响。

1. MDA-MB-231细胞系来源外泌体的作用：

   • 对糖酵解相关基因的影响：与对照组相比，经MDA-MB-231外泌体处理的PBMCs中，HK2 和 GLUT1 基因的表达水平均出现极显著升高（p < 0.0001）。这强烈提示，肿瘤细胞直接分泌的外泌体能够强力上调免疫细胞内糖酵解通路的关键元件。
   • 对免疫检查点基因的影响：与此同时，PD1 基因的表达水平也出现了极显著升高（p < 0.0001）。
   • 结果解读与关联：这是一个非常有意思的发现。传统认知中，PD1信号的激活会抑制下游的HK2和GLUT1，从而压制糖酵解。但本研究结果显示，在外泌体作用下，PD1 与 *HK2*、GLUT1 的表达出现了“同步上调”。这暗示，乳腺癌细胞外泌体可能通过某种机制，“劫持”或“绕过”了正常的PD1-HK2/GLUT1抑制轴。即，外泌体虽然提升了PD1的表达，但这种PD1的上调并未发挥其抑制代谢的生理功能，反而与促糖酵解基因的上调并存。作者在讨论中提出，这可能导致PD1-HK2-GLUT1代谢轴在受影响细胞中“失活”或“功能解耦联”。

2. 乳腺癌患者血清来源外泌体的作用：

   • 对糖酵解相关基因的影响：与对照组相比，经患者血清外泌体处理的PBMCs中，HK2 基因的表达水平显著升高（p < 0.0001）。然而，GLUT1 基因的表达虽有上升趋势，但未达到统计学显著性（p = 0.2020）。
   • 对免疫检查点基因的影响：PD1 基因的表达水平与对照组相比无显著差异（p = 0.7919）。
   • 结果解读与关联：患者血清外泌体同样能上调 *HK2*，表明其具有促进免疫细胞糖酵解的潜力。但与细胞系外泌体相比，其作用强度较弱且不全面（未显著影响 GLUT1 和 *PD1*）。这为后续的对比分析提供了基础。

3. 两种来源外泌体效果的对比：

   • 进一步的多重比较显示，在诱导 GLUT1 和 PD1 基因表达方面，MDA-MB-231细胞系来源外泌体的作用显著强于患者血清来源外泌体（p < 0.001 和 p < 0.0001）。仅在 HK2 基因的上调上，两者效果无显著差异（p = 0.9637）。
   • 结果解读：作者对这一差异给出了合理解释：MDA-MB-231是单一、纯净的肿瘤细胞系，其分泌的外泌体成分相对单一，更能代表“纯粹”的肿瘤信号。而患者血清是一个复杂的系统，其中的外泌体来源混杂，既包括肿瘤细胞，也可能来自血小板、免疫细胞等其他细胞，因此其携带的信号是“稀释的”或“混合的”，导致对免疫细胞的重编程能力弱于细胞系外泌体。这提示，在模拟肿瘤微环境方面，细胞来源的外泌体可能更具代表性。

五、 研究结论与价值

结论： 本研究证实，乳腺癌来源的外泌体（无论是来自细胞系还是患者血清）能够改变健康人外周血单个核细胞的基因表达谱，特别是上调糖酵解通路的关键基因 *HK2*。其中，纯净的肿瘤细胞系外泌体作用更为强烈和广泛，能够同时上调 *HK2*、GLUT1 和 PD1 的表达，且这种上调模式表明，肿瘤外泌体可能破坏了PD1对其下游代谢靶点的正常抑制性调控，即导致了PD1-HK2-GLUT1代谢轴的功能失调。

科学价值与应用价值： 1. 机制探索价值：该研究从一个新颖的视角——细胞外囊泡介导的代谢重编程，深化了对肿瘤免疫逃逸机制的理解。它不仅将外泌体通讯与免疫细胞代谢这两个前沿领域联系起来，还提出了肿瘤可能通过外泌体“解耦联”免疫检查点分子与其代谢抑制功能的新假说，为后续研究指明了方向。 2. 转化医学意义：研究结果提示，靶向肿瘤外泌体的产生、分泌或摄取，或者干预其介导的特定代谢重编程通路（如HK2），可能成为增强抗肿瘤免疫反应的新策略。例如，将外泌体抑制剂与现有的免疫检查点抑制剂（如抗PD-1抗体）联用，或许能克服由外泌体引起的免疫细胞代谢功能障碍，从而提高免疫治疗疗效。 3. 方法学与认知价值：研究通过对比细胞系外泌体和患者血清外泌体，揭示了实验模型中“纯净信号”与体内“复杂信号”的差异，提醒研究者在进行外泌体功能研究时，需谨慎选择外泌体来源并合理解读其结果。

六、 研究亮点

1. 新颖的研究角度：将外泌体生物学、免疫代谢和肿瘤免疫学交叉融合，探究外泌体作为“代谢重编程信使”的功能，选题具有前瞻性。
2. 严谨的实验设计：设置了双重外泌体来源（细胞系 vs. 患者血清）的对比，并设立了未处理对照组，结论更具层次性和说服力。
3. 全面的外泌体表征：在研究伊始即采用DLS和AFM两种物理学方法对外泌体进行严格鉴定，确保了后续功能实验所用材料的可靠性，符合国际细胞外囊泡学会（ISEV）指南的要求。
4. 发现了有趣的功能“解耦联”现象：研究结果挑战了PD1必然抑制糖酵解的传统线性认知，揭示了在肿瘤外泌体干预下，PD1表达上调与其代谢抑制功能可能分离的现象，提出了新的科学问题。
5. 明确的临床相关性：直接使用乳腺癌患者的血清样本进行研究，使得发现与临床实际情况的关联更为紧密，增强了研究的转化潜力。

七、 其他

研究团队在讨论部分也客观指出了本研究的局限性，例如仅检测了mRNA水平的变化，未来需要进一步在蛋白质水平验证GLUT1和HK2的表达及活性；研究聚焦于糖酵解通路，其他代谢途径（如氨基酸代谢、氧化磷酸化）可能也受外泌体调控，值得探索。此外，研究主要关注了PBMCs这一混合群体，未来可以分选具体的免疫细胞亚群（如CD8+ T细胞、单核/巨噬细胞）进行更精细的分析，以明确外泌体的主要作用靶点。

总而言之，这项研究为理解肿瘤如何利用外泌体远程操控免疫细胞的代谢状态以利于自身生存，提供了重要的实验证据和新的理论思路。