本研究由Marie-Lisa Eich、George J. Netto等多位学者共同完成，主要作者来自美国阿拉巴马大学伯明翰分校（The University of Alabama at Birmingham）病理学系、约翰霍普金斯大学（Johns Hopkins University）医学院及悉尼·金梅尔综合癌症中心（Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center）等机构。论文发表于《Modern Pathology》，2019年10月正式刊出，文章标题为《Incidence and distribution of uroseek gene panel in a multi-institutional cohort of bladder urothelial carcinoma》。
膀胱癌是男性第四常见恶性肿瘤，也是泌尿道最常见肿瘤。非肌层浸润性膀胱癌患者由于高复发率和进展风险，需要长期接受膀胱镜和尿细胞学随访，给医疗系统带来沉重经济负担。尿细胞学虽然是膀胱癌检测的金标准之一，但对低级别肿瘤敏感性很低（11%–76%）。近年来，研究者开发了一种非侵入性尿液分子检测方法UroSeek。该检测覆盖11个膀胱癌常见突变基因，包括TERT启动子（TERTseqs组件）以及FGFR3、PIK3CA、TP53、HRAS、KRAS、ERBB2、CDKN2A、MET、MLL和VHL（UroSeqS组件），并可结合非整倍体检测（FastSeqS）提高灵敏度。UroSeek在联合细胞学检查时，早期检测灵敏度达到95%，特异性为93%。但基于突变的非侵入性检测能否有效，关键在于其基因组合是否覆盖目标肿瘤的主要突变谱。因此，本研究旨在通过多机构、国际性、大规模队列，系统评估UroSeek基因组合在膀胱尿路上皮癌组织中的突变分布，并分析其与肿瘤分级、分期的关系。
本研究纳入1991年至2016年间来自四家国际学术机构（美国约翰霍普金斯医院、巴西A.C. Camargo癌症中心、日本大阪大学医院、土耳其哈塞特佩大学医院）的527例膀胱尿路上皮癌样本，来自484名患者。其中男性371例，女性113例，中位年龄68岁。组织学类型包括188例低级别非浸润性乳头状癌、129例高级别非浸润性乳头状癌、56例原位癌、111例pT1期肿瘤和43例≥pT2期肌层浸润性膀胱癌。所有切片均经泌尿病理医师复核，选取代表性肿瘤区域，从石蜡包埋组织中提取DNA。
突变分析采用SafeSeqS技术进行。这是一种具备测序错误校正能力的高灵敏突变检测方法，能够区分真正突变与测序过程中引入的人工变异。研究进行了两类突变检测：第一类是单重PCR检测TERT启动子区域（TERTseqs）；第二类是多重PCR检测10个基因的目标区域（UroSeqS）。为判断突变是否为真正体细胞突变，研究还分析了188名无关健康人白细胞DNA作为对照。若某变异在样本中的突变等位基因频率显著高于对照组中同一位点的最高频率，并满足Stouffer’s z-score统计标准，才判定为阳性突变。统计分析使用R 3.5.1进行，p<0.05为显著性标准，采用卡方检验评估突变状态与病理及预后变量的关系。
结果显示，总体上92%的膀胱肿瘤在UroSeek组合中至少携带一个基因突变。非浸润性肿瘤中93%阳性，浸润性肿瘤中92%阳性。TERT启动子突变在所有病例中的检出率为70%，最常见变异为g.1295228C>T，其次为g.1295250C>T，并发现一个新变异g.1295223G>T。低级别非浸润性乳头状癌的TERT启动子突变率为77%，显著高于高级别非浸润性乳头状癌和原位癌的65%（p=0.017）。pT1期肿瘤TERT启动子突变率为72%，肌层浸润性膀胱癌为63%，但差异无统计学意义。
在UroSeqS检测的10个基因中，FGFR3和PIK3CA突变在低级别非浸润性乳头状癌中的发生率显著高于高级别非浸润性乳头状癌和原位癌（FGFR3：46% vs 23%，p<0.0001；PIK3CA：19% vs 5%，p<0.0001）。相反，TP53突变在高级别非浸润性病变中更常见（28% vs 8%，p<0.0001）。在浸润性膀胱癌中，肌层浸润性膀胱癌的TP53和CDKN2A突变率显著高于pT1期肿瘤（TP53：54% vs 28%，p=0.005；CDKN2A：16% vs 5%，p=0.035）。FGFR3最常见的突变变体为p.S249C（67%），PIK3CA最常见为p.E545K（49%），CDKN2A最常见为p.H66P（79%）。此外，219例肿瘤同时存在TERTseqs和UroSeqS两种组件的突变；59%的TERT启动子突变肿瘤同时携带至少一个UroSeqS基因突变（p=0.001）。13例肿瘤存在多个TERT启动子变异，14例存在多个TP53变异，1例存在两种FGFR3变异。
在36例具有先后多个肿瘤组织的患者中进行了突变追踪分析。7例患者的所有肿瘤均无TERT启动子突变。其余29例中，22例在不同时间点的肿瘤中保持相同TERT启动子突变，7例则表现为变异存在或缺失的不一致模式。对于FGFR3，仅2/15例有FGFR3突变的患者在多次肿瘤中检测到相同突变。这一发现提示，如果患者首次肿瘤检测TERT启动子阳性，后续监测时可能无需重复检测肿瘤组织；但对于仅UroSeqS基因阳性的患者，由于肿瘤分子异质性可能较高，不宜采用同样的简化策略。
在预后分析中，303例有至少3个月随访资料的患者被纳入。发生复发的肿瘤中94%携带UroSeek基因突变，未复发肿瘤中95%携带突变，差异无统计学意义（p=0.784）。在21例出现进展的患者中，携带UroSeek基因突变的肿瘤比例为81%，显著低于无进展患者的96%（p=0.016）。这表明缺乏UroSeek所覆盖的常见驱动突变的肿瘤可能具有不同的分子背景，并可能与疾病进展相关，但其具体机制尚需进一步研究。
本研究是迄今最大规模的低级别非浸润性膀胱癌多基因检测评估之一，覆盖188例低级别肿瘤。在低级别非浸润性乳头状癌中，UroSeek组合捕获了98%的突变，其中TERTseqs阳性率77%，UroSeqS阳性率70%。这对于尿液细胞学敏感性极低的低级别肿瘤尤其重要。此前研究发现，49例低级别非浸润性乳头状癌尿液细胞学全为阴性，而尿液UroSeek在约三分之二的病例中呈阳性。虽然本研究仍为组织层面分析，但该高覆盖率支持UroSeek在尿液检测中的潜在应用价值。本研究的TP53突变率（54%）与癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA，48%）和Kim等（57%）的报道一致，但PIK3CA、ERBB2和MLL突变率相对较低。低级别肿瘤FGFR3突变率（46%）低于Hurst等对82例Ta肿瘤全外显子和靶向测序所得结果（79%），可能是由于本研究采用热点区域靶向测序而遗漏了非热点突变。
本研究通过多机构大队列证实UroSeek基因组合在膀胱癌各分级和分期中均表现为极高的覆盖率，92%的肿瘤至少存在一个可检测突变，低级别非浸润性乳头状癌高达98%。其中TERT启动子突变最常见，70%的肿瘤携带该突变。FGFR3和PIK3CA突变富集于低级别肿瘤，而TP53和CDKN2A突变富集于高级别或肌层浸润性肿瘤，这反映了膀胱癌在不同分子通路上的差异。这些结果支持UroSeek作为一种非侵入性尿液检测手段的潜在应用价值，尤其在低级别肿瘤中，常规细胞学敏感性不足的问题可能通过该分子检测得到改善。此外，对于复发监测策略，首次肿瘤中TERT启动子突变的持久性提示未来或可减少重复组织检测，而其余基因突变位点的不稳定性提示仍需更加个体化的监测策略。