本研究由来自中国医学科学院北京协和医学院国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/肿瘤医院妇科肿瘤科的Yunshu Zhu、Leilei Liang、Yuxi Zhao、Jian Li、Jia Zeng、Ning Li、Lingying Wu以及上海交通大学医学院附属同仁医院普外科的Yihang Yuan共同完成，并于2024年发表在*Journal of Nanobiotechnology*期刊上。

学术背景

该研究属于肿瘤学与分子生物学交叉领域，聚焦于卵巢癌的临床治疗难题。卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，超过80%的患者在初诊时已属晚期，五年生存率仅为41%。以铂类药物（如顺铂）为基础的化疗是晚期卵巢癌的一线标准治疗方案。然而，大多数患者最终会对铂类药物产生耐药性，导致疾病复发和预后极差，中位生存期不足12个月。因此，阐明铂类耐药的分子机制并寻找新的治疗靶点，对于改善卵巢癌患者预后具有至关重要的意义。

环状RNA（circular RNA, circRNA）是一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA，因其稳定性高、表达具有组织特异性，在癌症发生发展和治疗抵抗中扮演着重要角色，被认为是潜在的诊断标志物和治疗靶点。与此同时，p53蛋白是调控细胞稳态的关键转录因子，其稳定性受到泛素化修饰的精密调控。p53功能的失活与多种肿瘤的化疗耐药相关。然而，在铂类耐药的卵巢癌中，circRNA如何调控p53的泛素化过程，进而介导耐药，尚不明确。

本研究的主要目标是：1）鉴定在铂类耐药卵巢癌中发挥关键作用的circRNA；2）阐明该circRNA通过与p53相互作用介导耐药的分子机制；3）基于此发现，开发一种能够克服铂类耐药的新型纳米药物递送系统，为临床转化提供新策略。

详细研究流程

本研究包含一个系统的、多层次的实验流程，从临床样本筛查、分子机制探索到体内外功能验证，最终延伸到治疗性纳米系统的构建与评估。

第一环节：铂类耐药相关circRNA的筛选与鉴定 * 研究对象： 从中国医学科学院肿瘤医院收集的卵巢癌患者新鲜冷冻组织样本，包括14例铂类耐药（化疗后6个月内进展）和25例铂类敏感（化疗后≥6个月无进展）组织。其中4例耐药和5例敏感组织用于circRNA测序，其余用于验证。 * 样本处理与实验： 1. circRNA测序（circRNA-seq）： 对4例耐药和5例敏感组织进行高通量circRNA测序，分析差异表达的circRNA。 2. 生物信息学分析： 对差异circRNA进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）和基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析，发现其与PI3K-AKT信号通路、自噬等肿瘤进展和耐药相关通路有关。从中筛选出在耐药组织中显著上调（log2倍变化 > 2）的候选circRNA。 3. 验证与表征： * 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）： 在剩余的10例耐药和20例敏感组织以及卵巢癌细胞系（SKOV3， A2780及其对应的顺铂耐药株SKOV3/DDP， A2780/DDP）中验证候选circRNA的表达。最终锁定circNUP50（来源于NUP50基因第6号外显子）。 * Sanger测序： 验证circNUP50的反向剪接位点。 * 寡聚dT引物实验： 使用随机引物和寡聚dT引物进行反转录，证明circNUP50没有poly(A)尾巴，符合环状RNA特征。 * RNase R消化实验： circNUP50能抵抗RNase R（一种降解线性RNA的酶）的消化，进一步证实其环状结构。 * RNA荧光原位杂交（FISH）： 确定circNUP50在细胞内的定位，发现其同时存在于细胞核和细胞质中。 * 放线菌素D实验： 证明circNUP50比其线性异构体NUP50 mRNA更稳定，半衰期更长。

第二环节：circNUP50在卵巢癌铂类耐药中的功能研究 * 研究对象： SKOV3/DDP和A2780/DDP铂类耐药卵巢癌细胞系。 * 样本处理与实验： 1. 功能获得/缺失： 使用针对circNUP50反向剪接位点的小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）慢病毒载体转染耐药细胞，构建circNUP50敲低模型（si-circNUP50或sh-circNUP50细胞）。 2. 体外功能实验： * 细胞增殖实验（EdU法）： 检测circNUP50敲低后细胞的增殖能力。 * 细胞周期分析（流式细胞术）： 检测circNUP50敲低对细胞周期分布的影响。 * 细胞凋亡检测（Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术）： 检测circNUP50敲低后细胞的凋亡水平。 3. 体内功能验证（裸鼠皮下移植瘤模型）： 将稳定敲低circNUP50的SKOV3/DDP细胞（sh-circNUP50组）和对照细胞（sh-NC组）接种到裸鼠皮下。分组为：PBS对照、顺铂治疗组。监测肿瘤生长，评估circNUP50敲低联合顺铂对肿瘤生长的抑制效果。

第三环节：circNUP50介导铂类耐药的分子机制探索 此环节采用了多种分子生物学技术来揭示circNUP50的作用机制，涉及两个主要通路。

• 机制一：circNUP50作为蛋白支架调控p53泛素化

  1. circRNA下拉联合质谱分析（circRNA pull-down & Mass Spectrometry）： 用生物素标记的circNUP50探针从细胞裂解液中钓取与之结合的蛋白，进行银染和质谱鉴定。发现数百个结合蛋白，其中泛素结合酶E2T（UBE2T）引起了注意。
  2. 生物信息学分析： 对质谱数据进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析和GO分析，提示circNUP50结合蛋白参与泛素化过程。结合前期si-circNUP50细胞的mRNA测序结果（显示p53通路相关），提出假说：circNUP50可能作为支架促进UBE2T对p53的泛素化。
  3. 相互作用验证：
     • RNA结合蛋白免疫共沉淀（RIP）： 使用抗UBE2T和抗p53的抗体进行RIP实验，证实内源性circNUP50能与UBE2T和p53蛋白结合。
     • 标记RNA亲和纯化（TRAP）-Western Blot： 使用MS2噬菌体衣壳蛋白系统，体外验证circNUP50能直接结合UBE2T和p53蛋白。
     • 免疫共沉淀（Co-IP）： 证实UBE2T和p53蛋白在细胞内能相互结合。
     • 免疫荧光共定位： 显示UBE2T和p53蛋白在细胞质中共定位。
  4. 功能验证：
     • 蛋白质稳定性实验（环己酰亚胺CHX chase assay）： 过表达UBE2T会缩短p53蛋白的半衰期，促进其降解。
     • 泛素化实验： 在细胞中过表达UBE2T或circNUP50，均能增强p53的泛素化水平。敲低circNUP50则能增加p53蛋白的表达量。

• 机制二：circNUP50作为miRNA海绵调控下游基因

  1. miRNA测序（miRNA-seq）： 对铂类耐药和敏感组织进行miRNA测序，结合数据库预测，筛选出可能与circNUP50结合的miRNA，锁定miR-197-3p。qRT-PCR验证miR-197-3p在耐药组织和细胞中表达下调。
  2. 海绵作用验证：
     • circRNA下拉-qPCR： 证实circNUP50能特异性结合miR-197-3p。
     • RIP实验（使用抗Ago2抗体）： 证实circNUP50和miR-197-3p共同富集在RNA诱导沉默复合体（RISC）中。
     • FISH共定位： 显示circNUP50与miR-197-3p在细胞质中共定位。
     • 双荧光素酶报告基因实验： 证实miR-197-3p能与circNUP50以及其预测的靶基因G3BP1的3‘非翻译区（3’UTR）结合，并抑制报告基因活性。
  3. 下游靶基因功能研究：
     • 靶基因筛选与验证： 结合数据库预测和si-circNUP50细胞的mRNA测序数据，确定G3BP1是miR-197-3p的关键靶基因。qRT-PCR和生存分析显示G3BP1高表达与患者不良预后及铂类耐药相关。过表达miR-197-3p可下调G3BP1表达，而抑制miR-197-3p可逆转circNUP50敲低导致的G3BP1下调。
     • G3BP1调控p53泛素化的机制：
       • 蛋白质相互作用网络分析及实验验证： 发现G3BP1与去泛素化酶USP10相互作用，而USP10已知能稳定p53。Co-IP证实G3BP1与p53结合。
       • CHX chase实验： 过表达G3BP1会缩短p53蛋白的半衰期。
       • 泛素化实验： 过表达G3BP1能增强p53的泛素化水平。

第四环节：基于机制的纳米治疗系统开发与评估 * 研究对象： 卵巢癌原位移植瘤模型裸鼠（将表达荧光素酶的SKOV3/DDP细胞注射到裸鼠卵巢包膜下建立）。 * 纳米系统构建： 1. 设计与合成： 开发了一种共递送顺铂和si-circNUP50的纳米系统，命名为PSC@DPP。该系统采用乳化-溶剂蒸发法制备，核心由甲氧基聚乙二醇-聚乳酸（mPEG-PLA）和阳离子脂质体DOTAP组成。疏水的顺铂被包裹在PLA疏水核内，带正电的DOTAP通过静电作用吸附带负电的si-circNUP50。 2. 表征： 动态光散射和透射电镜显示PSC@DPP粒径约为150 nm，Zeta电位约为+15 mV。三维结构光照明显微镜和皮尔逊相关性分析证实顺铂和si-circNUP50被成功共装载于同一纳米颗粒中。该系统在血清中具有良好的稳定性。 * 体内疗效与安全性评估： 1. 疗效评估： 将荷瘤裸鼠分为四组：PBS对照组、游离顺铂组、顺铂+游离si-circNUP50组、PSC@DPP治疗组。通过活体成像监测肿瘤荧光信号。结果显示，PSC@DPP组肿瘤生长抑制效果最显著，明显优于游离药物联合组。 2. 安全性评估： 治疗后检测小鼠血液生化指标（如肝肾功能相关酶）及主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的病理切片（H&E染色），表明PSC@DPP具有良好的生物相容性和安全性，未引起明显的全身毒性或器官损伤。 3. 靶向性评估： 静脉注射后，在不同时间点检测肿瘤组织中的顺铂含量，显示PSC@DPP能更有效地将药物递送至肿瘤部位。

主要研究结果

1. circNUP50在铂类耐药卵巢癌中高表达且功能关键： circRNA-seq和qRT-PCR证实circNUP50在铂类耐药的组织和细胞系中显著上调。功能实验表明，敲低circNUP50能抑制耐药细胞的增殖、诱导G0/G1期细胞周期阻滞、促进细胞凋亡。体内实验进一步证明，敲低circNUP50能显著增强顺铂对耐药肿瘤的抑制作用。
2. circNUP50通过结合UBE2T促进p53泛素化降解： 质谱和一系列相互作用实验证实，circNUP50能同时结合UBE2T和p53蛋白，起到分子支架的作用。功能实验证明，circNUP50和UBE2T都能促进p53的泛素化，从而加速p53蛋白的降解。敲低circNUP50则能稳定p53蛋白水平。这揭示了一条circRNA直接调控关键肿瘤抑制蛋白稳定性的新通路。
3. circNUP50通过吸附miR-197-3p上调G3BP1，间接促进p53泛素化： 研究发现circNUP50能作为分子海绵吸附miR-197-3p，解除miR-197-3p对其靶基因G3BP1的抑制，导致G3BP1表达上调。进一步机制研究表明，G3BP1能与p53结合并促进其泛素化降解。这构成了circNUP50调控p53的另一条间接通路。
4. 新型纳米共递送系统PSC@DPP高效克服铂类耐药： 成功构建的PSC@DPP纳米系统能同时高效负载疏水药物顺铂和核酸药物si-circNUP50，并精准递送至肿瘤部位。在卵巢癌原位耐药模型中，PSC@DPP表现出远超游离药物组合的抗肿瘤疗效，且系统安全性良好。这为将基础研究发现转化为临床应用提供了可行的技术方案。

这些结果层层递进：首先确定了关键分子circNUP50；然后从“蛋白支架”和“miRNA海绵”两个角度深入阐明了其通过促进p53泛素化导致耐药的完整分子网络；最后，基于此机制设计出靶向治疗策略，并在复杂的体内模型中验证了其可行性，形成了从“机制发现”到“治疗应用”的完整闭环。

研究结论与价值

本研究得出结论：环状RNA circNUP50是卵巢癌铂类耐药的一个新型关键驱动因子。它通过双重机制——一方面作为支架蛋白直接招募UBE2T泛素化p53，另一方面作为海绵吸附miR-197-3p间接上调G3BP1促进p53泛素化——共同导致p53蛋白降解，从而促进肿瘤细胞存活和耐药。基于这一发现构建的共递送纳米系统PSC@DPP，能有效逆转卵巢癌的铂类耐药，为临床治疗提供了新的候选策略。

科学价值： 本研究首次揭示了circRNA通过调控p53泛素化途径介导卵巢癌铂类耐药的新机制，丰富了人们对非编码RNA在化疗耐药中作用的认识，特别是 circRNA 作为蛋白支架和 miRNA 海绵的双重功能在同一生物学过程中的协同作用。将 circRNA 研究与蛋白质泛素化修饰领域进行了创新性交叉。 应用价值： 研究不仅停留在机制阐释，更进一步开发了具有转化潜力的纳米治疗平台。circNUP50可作为预测铂类疗效的潜在生物标志物和逆转耐药的新治疗靶点。PSC@DPP纳米系统则为克服卵巢癌及其他恶性肿瘤的化疗耐药提供了新的药物递送思路和技术范例。

研究亮点

1. 机制创新性： 首次系统阐明了circNUP50通过“双管齐下”的机制（直接支架作用+间接海绵作用）汇聚于p53泛素化这一核心节点，驱动卵巢癌铂类耐药，机制阐述全面且深入。
2. 研究系统性： 从临床样本筛查（组织测序）到细胞分子机制（体外实验），再到动物模型验证（体内功能），最后到治疗策略开发（纳米药物），研究设计逻辑严谨，环节完整，证据链坚实。
3. 转化导向性： 研究并未止步于基础机制，而是极具前瞻性地将分子靶点（si-circNUP50）与传统化疗药物（顺铂）相结合，利用纳米技术构建协同治疗系统，并在模拟临床情境的原位动物模型中验证疗效，体现了强烈的转化医学特色。
4. 技术综合性： 研究中整合运用了高通量测序（circRNA-seq， miRNA-seq， mRNA-seq）、分子互作技术（RIP， Co-IP， Pull-down， 双荧光素酶报告基因）、细胞功能分析、活体成像、纳米材料制备与表征等多种前沿技术，展现了强大的多学科技术整合能力。

其他有价值的内容

研究中还利用公共数据库（如Kaplan-Meier plotter， ROC plotter）对关键分子（如BIRC3， BCL2， UBE2T， G3BP1）进行了大样本的生存分析和疗效预测验证，弥补了自身临床样本量的局限，增强了结论的普遍性和可靠性。同时，文章也客观指出了研究的局限性，即缺少大规模独立临床队列对UBE2T和G3BP1作为预后标志物进行验证，体现了科学的严谨性。