本研究由瑞典卡罗琳斯卡学院、皇家理工学院等机构的 Matilda Holm、Lina Stepanauskaitė 等学者主导完成，其成果以《Spatial profiling of the mouse colonic immune landscape associated with colitis and sex》为题，于2024年发表在《Communications Biology》期刊上。这是一项关于结肠炎背景下，小鼠结肠免疫微环境空间特征与性别差异的原创性研究。
学术背景与研究目标 炎症性肠病（Inflammatory Bowel Disease, IBD）及其相关的结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是全球性的重大健康负担。肠道微环境中的免疫细胞分布、相互作用及其功能状态深刻影响着炎症的发生、消退以及癌变进程。尽管已知多种免疫细胞在IBD中发挥作用，但对它们在健康和炎症状态下结肠内的空间分布格局以及细胞间的空间相互作用尚缺乏全面的认识。同时，IBD和CRC在发病率、疾病进程和治疗反应上均存在显著的性别差异，但其背后的免疫学机制，特别是在组织原位水平上的差异，研究甚少。
以往的研究多采用流式细胞术或单细胞RNA测序等技术，虽然能鉴定细胞类型和丰度，但丢失了宝贵的空间位置信息。而新兴的空间转录组学等技术，在本研究开展时，尚未被广泛应用于系统性描绘结肠的免疫景观及其性别差异。因此，本研究旨在利用新颖的空间蛋白组学技术，以前所未有的空间分辨率，全面描绘小鼠结肠在稳态和结肠炎状态下，多种免疫细胞群体的浸润、空间分布、邻近关系以及细胞间相互作用的动态变化，并重点揭示其中存在的性别差异。
详细研究流程 本研究是一项整合了动物模型、先进成像技术和复杂数据分析的系统性工作，主要流程如下：
1. 动物模型与样本制备 研究使用广泛认可的氧化偶氮甲烷（Azoxymethane, AOM）/葡聚糖硫酸钠（Dextran Sulfate Sodium, DSS）诱导的小鼠结肠炎相关癌变模型。共纳入16只C57BL/6J背景的野生型小鼠，雌雄各半。其中6只（雌雄各3）作为对照组，仅接受生理盐水注射；10只（雌雄各5）接受AOM注射和三轮DSS饮水以诱导结肠炎。实验终点（第9周）收集小鼠结肠，采用“瑞士卷”（Swiss-roll）技术将整个结肠纵向卷起并固定、包埋。这种制备方法使得长度约13厘米的小鼠整段结肠能够被完整地包含在一个组织切片中，为后续的全长空间分析提供了可能。
2. 多重免疫荧光染色与成像——COMET平台的应用 研究的核心技术亮点是采用了Lunaphore公司的COMET自动化多重免疫荧光平台。研究人员优化并使用了包含10个标志物的抗体组合（见表1），旨在同时原位检测9种主要的免疫细胞群体：细胞毒性T细胞（Cytotoxic T cells, Tc cells, CD8+）、辅助性T细胞（Helper T cells, Th cells, CD4+）、调节性T细胞（Regulatory T cells, Treg cells, Foxp3+）、B细胞（CD86+，并通过排除巨噬细胞和树突状细胞标志物进行富集）、树突状细胞（Dendritic cells, DCs， CD11c+）、中性粒细胞（Ly-6G+）、M1样巨噬细胞（F4/80+CD86+）、M2样巨噬细胞（F4/80+CD206+）以及NK细胞（Klrb1c+）。COMET平台通过微流控技术进行循环的抗体染色、成像和洗脱，最终将所有循环的图像自动对齐、叠加，生成一张包含所有10个通道荧光信号的高分辨率全景图像。这种方法在单张切片上实现了对9种细胞群体的原位、同步空间图谱绘制。
3. 图像分析与数据提取 使用开源软件QuPath对COMET生成的图像进行定量分析。首先，手动标注出结肠黏膜层和肌肉层区域，并排除非特异性染色或组织撕裂等区域。然后，利用StarDist深度学习扩展进行细胞核分割。接着，为每个荧光通道（即每个标志物）建立分类器，设定阈值以准确识别阳性细胞。最终，软件输出每个被识别细胞的空间坐标（X, Y）以及其在10个通道中的荧光强度值，构成了后续所有分析的数据基础。
4. 数据分析策略：三管齐下 研究采用了三种互补的数据分析策略，以从不同维度挖掘空间信息： * 无监督聚类与空间相互作用分析： 首先，利用所有样本中所有细胞的10个标志物荧光强度进行无监督聚类分析（使用R语言的FlowSOM包）。将细胞分为9个簇，其中8个被鉴定为免疫细胞簇（如Treg簇、DCs簇、中性粒细胞簇等）。接着，使用空间图像组织分析（Spatial Image Analysis of Tissues, SPIAT）R包，基于细胞的坐标数据，计算不同簇内细胞之间、不同簇细胞之间的成对距离。特别关注距离在20微米以内的“近距离相互作用”，认为这可能预示着直接的细胞间接触或通信。该分析在全样本层面以及按性别分层后进行。 * 手动量化与纵向空间分析： 为了验证聚类结果并对特定细胞（如NK细胞、M1巨噬细胞）进行更精确的量化，研究还根据预设的标志物组合和阈值进行了手动细胞计数。更重要的是，他们将每个“瑞士卷”样本图像划分为近端、中段和远端结肠三个区域，以及结肠炎样本中出现的鳞状上皮化生（Squamous metaplasia）区域，分别计算各免疫细胞在不同区域的浸润百分比，从而揭示了免疫浸润沿结肠近-远端轴的纵向分布梯度。 * 血浆细胞因子分析： 为了将局部结肠免疫景观与系统性免疫反应关联，研究者使用ELLA自动化免疫分析系统检测了同一批小鼠血浆中六种细胞因子（IFN-γ, IL-6, TNF-α, IL-1β, IL-17, CCL2）的水平，并按性别进行了比较。
主要研究结果 1. 结肠炎重塑结肠免疫景观并促进免疫细胞间相互作用： 无监督聚类成功识别出与预期相符的免疫细胞群体。定量分析显示，在AOM/DSS诱导的结肠炎状态下，除了M2样巨噬细胞显著减少外，其他所有被研究的免疫细胞在结肠黏膜层的浸润均显著增加。空间相互作用分析揭示，在健康结肠中，免疫细胞间的近距离（<20 μm）相互作用主要发生在同种细胞群体内部，而异种细胞群体间的近距离接触很少。然而，在结肠炎状态下，多种异种免疫细胞群体间的近距离相互作用显著增加。例如，Treg细胞与DCs之间、DCs与B细胞之间、以及Treg细胞与中性粒细胞之间的近距离接触在炎症结肠中变得极为频繁。这些发现与已知的免疫细胞通过直接接触进行抗原提呈、共刺激或抑制的生物学机制相符，验证了空间分析方法的准确性。
2. 结肠免疫景观存在显著的性别差异： 这是本研究最核心的发现之一。 * 在稳态（健康）结肠： 雌性小鼠的结肠黏膜含有更多辅助性T细胞（Th cells），并表现出Th细胞由近端向远端递减的梯度，而雄性则分布较均匀。雌性在远端结肠有更多B细胞，在中段和远端有更多中性粒细胞。相反，雄性小鼠的M2样巨噬细胞浸润表现出沿近-远端轴增加的梯度。空间相互作用分析发现，中性粒细胞与M2样巨噬细胞之间的近距离接触仅存在于雌性小鼠的健康结肠中。 * 在结肠炎状态下： 性别差异更为明显。雄性小鼠对结肠炎的免疫反应更剧烈，尤其表现在远端结肠：B细胞浸润显著增加（雌性无此现象），而具有抗炎作用的M2样巨噬细胞浸润显著减少。此外，雄性的细胞毒性T细胞（Tc cells）和辅助性T细胞（Th cells）在整个结肠的浸润增加幅度也大于雌性。雌性小鼠则表现出不同的反应模式：其中段结肠的M2样巨噬细胞浸润在结肠炎时特异性增加。 * 在鳞状上皮化生区域： 该区域呈现出强烈的多种免疫细胞浸润。其中，NK细胞和中性粒细胞的浸润在雄性小鼠中显著高于雌性，而DCs的浸润则在雌性中更突出。 * 系统免疫反应印证组织差异： 血浆细胞因子分析提供了系统性证据。雌性小鼠在健康状态下有更高的IFN-γ基线水平，并在结肠炎时表现出CCL2、TNF-α和IL-6水平的特异性显著升高。这些系统性的性别差异与观察到的局部组织免疫细胞浸润差异（如M2巨噬细胞、NK细胞）相呼应。
3. 免疫浸润具有沿结肠近-远端轴的纵向梯度，且远端结肠在结肠炎中最受影响： 手动纵向量化分析发现，即使在健康状态下，免疫细胞的分布也非均一。例如，Tc细胞和B细胞在近端结肠更丰富，而中性粒细胞和M2样巨噬细胞则向远端递增。诱导结肠炎后，远端结肠是受影响最严重的区域，绝大多数促炎免疫细胞（Th细胞、NK细胞、中性粒细胞、B细胞、DCs）在此处的浸润增加最为显著。同时，抗炎的M2样巨噬细胞在雄性小鼠的远端结肠显著减少。这为临床上IBD病变的分布特点以及AOM/DSS模型肿瘤好发于远端结肠提供了免疫学解释。
4. 鳞状上皮化生区域是免疫细胞的“热点”区域： 研究者特别注意到结肠炎样本中出现的鳞状上皮化生区域。该区域显示出异常强烈的免疫细胞浸润，B细胞、Th细胞、NK细胞、Treg细胞和中性粒细胞的浸润水平显著高于结肠的任何其他区域（近端、中段、远端）。这提示慢性的炎症损伤与修复循环创造了独特的免疫微环境。
结论与研究价值 本研究通过创新的空间蛋白组学方法，首次系统性地绘制了小鼠结肠在稳态和炎症状态下的高分辨率免疫细胞空间图谱，并深刻揭示了其中存在的性别二态性。其结论可总结为：1）结肠炎导致结肠免疫微环境从相对隔离的状态转变为免疫细胞间相互作用高度活跃的网络状态；2）结肠的免疫景观存在固有的性别差异，且雌雄小鼠对结肠炎的免疫应答策略不同——雄性表现为以远端结肠B细胞增多和M2巨噬细胞减少为特征的更强促炎反应，而雌性则表现出不同的调节模式（如中段M2巨噬细胞增加）；3）远端结肠是炎症反应的核心区域；4）鳞状上皮化生区域形成了高度免疫浸润的特殊生态位。
本研究的科学价值在于：它将空间维度系统地引入结肠免疫微环境的研究，超越了单纯的细胞计数，转向理解细胞的空间组织和相互作用网络。研究明确地将性别作为一个关键生物学变量，为理解IBD和CRC的性别差异提供了坚实的原位免疫学证据和机制线索。例如，雄性远端结肠促炎增强、抗炎减弱的免疫特征，可能解释了为何男性IBD患者CRC风险更高，以及为何某些抗炎治疗（如抗TNF疗法）在男性中疗效可能较差。
其应用价值在于：所构建的详细空间免疫图谱可作为未来研究肠道炎症和癌症的基准参考。揭示的关键免疫相互作用和性别特异性靶点，为开发更具针对性、 perhaps 性别分层（sex-stratified）的免疫治疗策略（如针对特定细胞相互作用的抑制剂或调节剂）提供了新的思路和潜在靶标。
研究亮点 1. 技术创新性： 率先将COMET高通量多重免疫荧光平台应用于系统性描绘整段结肠的复杂免疫微环境，实现了对9种免疫细胞群体的同步原位空间分析。 2. 分析维度全面： 结合了无监督聚类（识别细胞群体）、空间邻近分析（量化细胞相互作用）、手动区域量化（揭示纵向梯度与特定病理区域）以及血浆细胞因子检测（关联系统免疫），多角度、多层次地解析了数据。 3. 核心科学发现突出： 清晰揭示了结肠免疫景观在空间分布、细胞互作及炎症应答上的显著性别差异，特别是雄性远端结肠的特异性促炎模式，为领域提供了重要的新见解。 4. 模型与方法的严谨性： 使用标准化的AOM/DSS模型和“瑞士卷”技术，确保了空间分析的可重复性和完整性。抗体面板经过严格优化和验证，保证了数据质量。
其他有价值内容 研究也坦诚讨论了其局限性：例如，由于抗体特异性限制，未能涵盖所有免疫细胞亚型；CD86标记的B细胞群体可能包含其他少量表达CD86的细胞；无法区分中性粒细胞与多形核髓源性抑制细胞（PMN-MDSCs）；软件量化存在一定误差等。这些讨论增加了研究的透明度和可靠性。研究人员公开了分析代码和数据，促进了研究的可重复性和后续利用。