关于蛋白制剂中金属螯合剂作用的学术研究报告
一、 作者、机构与发表信息
本研究由斯洛文尼亚卢布尔雅那大学药学院（Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana）的Ema Valentina Brovc、Stane Pajk、Janez Mravljak（通讯作者）与诺华公司（Novartis）生物制剂技术开发部的Roman Šink共同完成。研究成果以题为“Protein Formulations Containing Polysorbates: Are Metal Chelators Needed at All?”的论文形式，于2020年5月20日发表在学术期刊《Antioxidants》（2020年第9卷第5期，文章编号441）上。
二、 研究背景与目的
学术领域： 本研究属于生物制药、蛋白质制剂稳定性和药物分析化学的交叉领域，核心关注蛋白质药物的化学降解机制及其稳定化策略。
研究背景与动机： 蛋白质药物在生产和储存过程中易发生多种翻译后修饰，其中氧化修饰是关键降解途径之一，可影响蛋白质的理化性质、生物活性、安全性和有效性。活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是导致氧化的主要原因。微量过渡金属离子（如铁Fe(II)、铜Cu(I)）的存在能通过芬顿反应（Fenton Reaction）催化ROS（尤其是高活性的羟基自由基•OH）的生成，从而加剧蛋白质氧化。在生物制药工业中，当检测到蛋白质发生氧化修饰时，常规做法是在制剂配方中添加金属螯合剂（如乙二胺四乙酸EDTA、二亚乙基三胺五乙酸DTPA），以期通过螯合金属离子来抑制金属催化的氧化反应。
然而，现有文献关于螯合剂作用的报道存在矛盾。一些研究表明，螯合剂能有效保护蛋白质；而另一些研究则指出，螯合剂与金属形成的复合物可能改变反应机制，反而加速•OH的产生和蛋白质氧化。特别是，聚山梨酯（Polysorbates, PS）作为蛋白制剂中最常用的表面活性剂之一，其自身易发生自氧化产生过氧化物，这些过氧化物在金属离子存在下可进一步转化为ROS，引发复杂的降解循环。因此，不加区分地添加螯合剂可能适得其反。
研究目的： 本研究旨在系统评估在含有聚山梨酯的蛋白制剂中，添加金属螯合剂（EDTA和DTPA）是否总是有益。研究通过模拟制剂环境，探究不同金属离子（Fe(III)和Cu(II)）与螯合剂组合对羟基自由基生成、模型蛋白氧化以及聚山梨酯自身氧化的影响，从而为蛋白制剂配方的科学设计提供基于实验数据的决策依据，而非仅依赖惯例。
三、 详细研究流程与方法
本研究包含三个核心实验流程，采用多种分析技术综合评价螯合剂的作用。
流程一：抗坏血酸氧化还原系统测定羟基自由基生成 此流程旨在动态监测不同条件下羟基自由基（•OH）的生成速率。 1. 实验原理： 利用抗坏血酸（Ascorbate）还原体系。抗坏血酸能将Fe(III)持续还原为Fe(II)，Fe(II)可依次将氧气还原为超氧自由基、过氧化氢，最终通过芬顿反应将过氧化氢转化为•OH。生成的•OH与荧光探针香豆素-3-羧酸（CCA）反应，生成强荧光产物7-羟基-CCA，通过监测荧光强度变化即可间接量化•OH的生成速率。 2. 研究对象与处理： 在96孔黑色微孔板中进行反应。设置多组实验条件，变量包括： * 金属离子： Fe(III) (10 µM) 或 Cu(II) (10 µM)。 * 螯合剂/抗氧化剂： EDTA (10 µM)、DTPA (10 µM)、谷胱甘肽（GSH, 10 µM）、槲皮素（Quercetin, 10 µM）。 * 其他组分： 添加治疗性蛋白溶液（250 µg/mL）或聚山梨酯80（PS80, 10 µg/mL），以模拟实际制剂环境并考察其对•OH的竞争性消耗。 * 对照： 设置仅含抗坏血酸和金属离子的阳性对照，以及不含金属离子或含螯合剂/抗氧化剂的阴性对照。 * 所有溶液均在含有1 µM去铁胺（Desferrioxamine，一种强铁螯合剂，用于控制本底铁）的磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中制备。 3. 实验方法： 按特定顺序加入CCA、螯合剂/抗氧化剂、金属离子，孵育30分钟后加入抗坏血酸启动反应。立即使用荧光酶标仪（λex=395 nm, λem=450 nm）连续监测荧光信号随时间的变化，绘制动力学曲线，并计算初始反应速率进行比较。 4. 数据分析： 通过比较不同条件下荧光强度-时间曲线的斜率和最终平台值，评估各因素对•OH生成是促进还是抑制。
流程二：肽图分析评估蛋白质氧化程度 此流程旨在直接定量评估不同应激条件下治疗性蛋白中甲硫氨酸（Methionine）的氧化水平。 1. 实验原理： 蛋白质氧化（如甲硫氨酸氧化为甲硫氨酸亚砜）会改变其酶切肽段的质量和疏水性。通过特异性蛋白酶（本研究中使用Lys-C）将蛋白质消化成肽段，然后利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）结合紫外检测（UV）分离这些肽段。通过比较氧化肽段与未氧化肽段的色谱峰面积，可以精确定量特定位点的氧化比例。 2. 研究对象与处理： 使用一种治疗性蛋白溶液。设置五组不同的氧化应激条件进行孵育（37°C，42小时）： * 组1：对照（无添加物）。 * 组2：仅添加Fe(III) (0.1 mM)。 * 组3：添加Fe(III) (0.1 mM) 和抗坏血酸 (3 mM)。 * 组4：添加Fe(III) (0.1 mM) 和 EDTA (0.1 mM)。 * 组5：添加Fe(III) (0.1 mM)、EDTA (0.1 mM) 和抗坏血酸 (3 mM)。 3. 实验方法： 孵育结束后，对样品进行还原、烷基化处理，然后用Lys-C蛋白酶进行酶切消化。将消化后的肽段混合物进行RP-HPLC-UV分析。 4. 数据分析： 在色谱图中识别并积分目标甲硫氨酸所在肽段的氧化峰和未氧化峰。氧化水平以氧化肽段的峰面积占总峰面积（氧化+未氧化）的百分比表示。通过比较各组百分比，评估不同条件（尤其是EDTA存在下）对蛋白质氧化的实际影响。
流程三：聚山梨酯氧化降解产物的分析与鉴定 此流程旨在研究金属离子催化下聚山梨酯（PS20和PS80）的氧化降解过程，并鉴定其产物。 1. 研究对象与处理： 将PS20和PS80（10 mmol/L）溶于乙醇-水混合溶剂中，加入Cu(II)硫酸盐（0.5 mmol/L）和抗坏血酸（1 mmol/L）以模拟氧化应激条件。在37°C下振荡孵育72小时，诱导氧化降解。 2. 衍生化与质谱分析： 氧化后的样品进行两步分析： * 衍生化-HRMS分析： 使用7-(二乙氨基)香豆素-3-碳酰肼（CHH）对氧化产生的低分子量和高分子量羰基化合物（如醛、酮）进行化学衍生，以提高其质谱检测灵敏度。衍生化产物通过直接进样，采用高分辨率质谱（HRMS）进行鉴定。 * 非衍生化-UHPLC-HRMS分析： 直接对氧化前后的聚山梨酯样品进行超高效液相色谱-高分辨率质谱（UHPLC-HRMS）分析，以获得完整的组成谱图。 3. 色谱与质谱条件： 使用C18反相色谱柱进行分离，采用正离子电喷雾电离（ESI+）模式的Q Exactive Plus混合四极杆-轨道阱质谱仪进行检测。通过对比氧化前后样品的总离子流色谱图（TIC）和质谱图，识别降解产物的结构，并观察酯类组分（如单酯、双酯、三酯）的相对丰度变化。 4. 数据分析： 定性鉴定氧化产生的具体醛、酮等羰基化合物。通过比较氧化前后色谱图中各酯类组分的峰强度变化，半定量评估不同酯类的氧化敏感性。
四、 主要研究结果
1. 抗坏血酸氧化还原系统测定结果： * 铁（Fe(III)）体系： EDTA的加入强烈加速了•OH的生成。相比之下，DTPA的加入则未观察到加速效应，其曲线与阴性对照组相似。抗氧化剂GSH和槲皮素也未加速反应。当在体系中加入治疗性蛋白或PS80后，由于它们与CCA竞争消耗•OH，所有条件下的荧光信号均有所降低，但“Fe(III)+抗坏血酸+EDTA”组合仍显示出最高的•OH生成速率。这表明在铁存在下，EDTA非但不能抑制，反而显著促进了芬顿反应。 * 铜（Cu(II)）体系： Cu(II)离子本身具有高反应性，即使不加螯合剂也能加速•OH生成。有趣的是，EDTA的加入几乎完全抑制了Cu(II)催化的•OH产生。DTPA的加入也表现出抑制作用，但不如EDTA彻底。抗氧化剂对铜体系无显著影响。加入蛋白质后，EDTA和DTPA均能完全抑制•OH的生成。 * 核心发现： 螯合剂对芬顿反应的影响高度依赖于金属离子的种类。EDTA对铁催化反应是强促进剂，而对铜催化反应是强抑制剂。DTPA对两者均有不同程度的抑制或无明显影响。
2. 肽图分析结果： 肽图分析直接证实了抗坏血酸体系观察到的趋势，并量化了对蛋白质的实际氧化损伤。 * 对照组和仅添加Fe(III)或Fe(III)+EDTA（不含抗坏血酸）的样品，甲硫氨酸氧化水平很低（~1.7-1.8%），说明单独金属或螯合剂不足以引发显著氧化。 * 添加Fe(III)和抗坏血酸后，氧化水平上升至6.4%，证实了还原剂存在下金属催化的氧化发生。 * 最关键的结果出现在第五组： 当同时存在Fe(III)、EDTA和抗坏血酸时，甲硫氨酸氧化水平急剧升高至12.9%，几乎是第三组的两倍。 * 结果解释： 该数据直接证明，在铁和还原剂（如抗坏血酸或制剂中可能存在的其他还原性杂质）共存的情况下，添加EDTA显著加剧了治疗性蛋白的氧化损伤。这与“添加螯合剂可防止氧化”的常见假设完全相反，并支持了抗坏血酸实验中EDTA加速铁介导•OH生成的结论。
3. 聚山梨酯氧化降解分析结果： * 氧化产物鉴定： 通过衍生化-HRMS方法，从氧化的PS20中鉴定出18种氧化产物，从PS80中鉴定出多达39种氧化产物。PS80产生的产物更多，与其含有更高比例的不饱和脂肪酸（如油酸C18:1、亚油酸C18:2、亚麻酸C18:3）相一致，这些不饱和键是脂质过氧化的主要位点。主要产物为低分子量醛类（≤C8），它们化学性质活泼，可能进一步与蛋白质发生交联反应。 * 组成谱变化（UHPLC-HRMS）： * PS20： 氧化后，色谱图中代表月桂酸单酯的主峰几乎完全消失，仅残留少量单酯和双酯，非酯化物种成为主要成分。这表明氧化攻击了聚山梨酯的酯键和聚氧乙烯链。 * PS80： 氧化后，非酯化物种丰度大幅增加，单酯和多酯比例显著下降，三酯则被完全降解。整个色谱图发生偏移，表明氧化导致了广泛的化学结构改变。 * 结果意义： 该部分研究不仅证实了聚山梨酯在金属/抗坏血酸体系下易发生氧化，更重要的是建立并验证了一套基于UHPLC-HRMS和化学衍生化的方法，可用于系统监测和鉴定聚山梨酯的氧化降解产物，这对制剂稳定性研究具有重要工具价值。
五、 研究结论与价值
结论： 1. 螯合剂的作用并非总是有益，且具有金属特异性： 在含有聚山梨酯的蛋白制剂中，盲目添加金属螯合剂（如EDTA）作为抗氧化措施可能是有害的。本研究证实，当污染金属是铁（Fe） 时，EDTA会强烈加速铁催化的芬顿反应，增加羟基自由基的生成，从而加剧蛋白质的氧化损伤。而当污染金属是铜（Cu） 时，EDTA和DTPA则能有效抑制铜催化的氧化反应。 2. 制剂配方决策应基于实验数据： 不能将“添加螯合剂”视为防止蛋白质氧化的通用法则。是否添加、添加何种螯合剂（EDTA或DTPA），必须根据制剂中可能存在的特定金属污染物（通过监测控制）、其他组分（如还原性物质、聚山梨酯类型）以及全面的稳定性实验数据来综合判断和论证。 3. 聚山梨酯氧化是一个需要监控的风险： 聚山梨酯（尤其是PS80）本身易受金属催化氧化，产生大量活性羰基化合物，这些产物可能直接损害蛋白质稳定性。控制过渡金属离子水平对于防止聚山梨酯和蛋白质的双重氧化至关重要。
科学价值与应用价值： * 科学价值： 本研究清晰地揭示了在生物制药相关条件下，金属螯合剂对氧化反应的复杂双重作用（促进或抑制），深化了对金属催化氧化机制的理解，特别是明确了铁-EDTA复合物的促氧化风险。 * 应用价值： * 为制剂科学家提供了关键的处方设计指导： 强调了对金属螯合剂的使用需要进行基于具体配方的风险评估和实验验证，避免因遵循“惯例”而引入不稳定性风险。 * 提供了先进的分析方法： 建立的抗坏血酸氧化还原系统测定法可用于快速筛选不同螯合剂/抗氧化剂组合的效果；建立的基于UHPLC-HRMS的聚山梨酯氧化产物分析方法，为复杂制剂中辅料降解的监控提供了强大工具。 * 促进了对蛋白制剂稳定性的全面理解： 将蛋白质氧化、辅料氧化和金属催化三者联系起来，强调了在稳定性考察中需要系统评估整个制剂体系，而非孤立看待单个组分。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究还指出，EDTA可能促进金属离子从不锈钢设备等接触表面迁移到溶液中，这反而可能增加制剂中的金属负载，从而在特定条件下放大氧化风险。这进一步支持了谨慎使用EDTA的观点，并提示在制剂生产和包装过程中，除了化学添加剂，还需关注与金属物料的相容性问题。
这项研究是一项结合了深刻机制洞察和强烈实践指导意义的优秀工作，它告诫生物制药领域的研发人员：在追求制剂稳定性的道路上，没有“放之四海而皆准”的简单答案，唯有依赖严谨的科学实验和具体的体系分析。