主要作者及发表信息
本研究由Philipp C. Manegold、Joerg Hutter、Sascha A. Pahernik、Konrad Messmer及Marc Dellian共同完成。研究团队主要来自德国慕尼黑路德维希-马克西米利安大学（Ludwig-Maximilians-University Munich）大哈登临床中心（Klinikum Grosshadern）的外科研究所（Institute for Surgical Research）和耳鼻喉科，以及美因茨大学（University of Mainz）的泌尿外科。该研究发表于《Blood》期刊2003年3月1日第101卷第5期（页码1970-1976），由美国血液学会（American Society of Hematology）出版。
研究背景
恶性肿瘤患者常伴随凝血与纤溶系统异常，这是一种被广泛认知的副现象（epiphenomenon），可导致血栓形成及血栓栓塞并发症。肿瘤细胞本身通过直接激活凝血过程并释放细胞因子和生长因子而表现出高促凝潜能。同时，实体瘤的微循环具有异质性，其特征包括组织灌注不良、局部缺氧、血流缓慢，以及非内皮细胞参与血管腔形成的“嵌合血管”（mosaic vessels）。
活化的凝血过程与肿瘤血管生成密切相关。其中，组织因子（tissue factor）通过其胞内结构域调控血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的合成；VEGF又反过来诱导内皮细胞表达组织因子，从而促进凝血酶（thrombin）形成，而凝血酶是内皮细胞的有效促分裂原。除了血浆凝血因子外，血小板在血管生成中的作用日益受到关注。体外实验已证实血小板储存有VEGF和血管生成素-1（angiopoietin-1）等促血管生成因子及抗血管生成因子，这些因子在血小板活化聚集时会释放。基于恶性肿瘤伴随凝血激活、肿瘤微循环血流缓慢及血管通透性增高的现象，有学者（Pinedo等）提出了血小板可能在肿瘤生长部位形成微血栓并释放血管生成因子的假说。
本研究旨在通过体内实验，可视化观察肿瘤微循环中的血小板，定量分析在肿瘤生长过程中及内皮细胞受刺激后，血小板与处于血管生成状态的微血管内皮层的相互作用，并与正常皮下组织进行对比。
详细工作流程
一、实验准备与动物模型
实验采用雄性C57BL/6J小鼠（6-8周龄，体重20-25克）作为实验动物和血小板供体。肿瘤细胞植入后，小鼠置于32°C、相对湿度50%的监护孵育箱中饲养4天，之后移至室温环境。所有实验程序均获得德国动物保护相关法规批准。
通过手术为小鼠安装背侧皮褶窗（dorsal skinfold chamber）以进行活体显微观察。具体方法为：麻醉小鼠后，去除背部毛发，用两个对称钛框夹住延展的双层皮褶，在直径15毫米的圆形区域内完全去除一层皮肤，剩余表皮、皮下组织和横纹肌层用玻片覆盖，玻片嵌入其中一个钛框中。术后48小时恢复期后，选择微循环状态完好的皮窗，植入1×10⁵个来自两种同源肿瘤之一的细胞：LLC-1（源自Lewis肺癌（Lewis lung carcinoma）的细胞系）或BFS-1（甲基胆蒽诱导的纤维肉瘤（methylcholanthrene-induced fibrosarcoma））。无肿瘤的皮窗作为对照。
二、血小板采集与标记
血小板制备和体外荧光标记基于既往文献方案并加以改良。每项实验采集一只同源供体鼠的1毫升心脏血，与柠檬酸-柠檬酸钠-葡萄糖抗凝液、前列腺素E1（PGE1）及Dulbecco磷酸盐缓冲液（D-PBS）混合。经130g离心10分钟获取富血小板血浆（platelet-rich plasma），再次加入抗凝和缓冲体系后，使用氨基反应性羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFDA-SE）进行荧光标记，随即以1430g二次离心10分钟，将血小板沉淀重悬于0.4毫升D-PBS中。最终，受体小鼠通过尾侧静脉输注100×10⁶个荧光标记的同源血小板，约占其循环血小板总数的10%。
为验证标记后血小板的功能是否完整，研究者采用流式细胞术（FACS）分析血小板在腺苷二磷酸（ADP）和不同浓度人凝血酶激活前后的变化，通过前向角/侧向角散射光图谱发现，标记血小板在激活后呈现向更高颗粒度和体积迁移的细胞群体，证明聚集功能正常。此外，通过聚集度测定（aggregometry）也证实标记血小板对人凝血酶（2 U/ml）反应呈现双相聚集曲线，即先发生分泌非依赖的可逆性聚集，随后因α颗粒释放导致不可逆性聚集。体内对照实验亦显示，在肠道缺血/再灌注损伤模型中，CFDA标记的血小板与若丹明6G（rhodamine 6G）标记的血小板在小动脉和毛细血管后微静脉中的相互作用与聚集程度相当。
三、活体荧光显微镜观察与分析
清醒状态的小鼠固定于连接计算机控制载物台的有机玻璃管中，以便对同一血管段进行反复定位观察。使用20倍水浸物镜在落射荧光照明下进行观察，图像通过CCD摄像头采集并记录于S-VHS录像带供离线分析。为同时显示微血管形态及血小板，静脉输注两种荧光示踪剂：采用四甲基罗丹明标记的氨基葡聚糖（TAMRA-dextran，分子量500,000）使血浆显像以展示血管分布和血流，血小板则经由CFDA标记而显像。两者的选择性可视化通过切换不同的荧光滤光片组实现。
在影像回放时借助计算机辅助图像分析系统（CAP Image）进行定量测量。通过TAMRA-dextran图像测量血管直径（单位：微米）和红细胞中心线流速（单位：毫米/秒），并以牛顿流体定义计算管壁剪切率（wall shear rate）。血小板按其与内皮层的相互作用分为自由流动、滚动和黏附三类。滚动血小板定义为穿越某预设垂直线的细胞，其速度显著低于该微血管的中心线流速，其数量以“每秒每血管直径的个数”（1/mm/s）表示；黏附血小板定义为在30秒观察期内、于100微米长血管段内不发生移动或脱离内皮的细胞，以“每平方毫米内皮表面的细胞数”（1/mm²）表示。
四、实验方案实施
研究设置两大系列实验。第一系列在肿瘤血管生成的连续阶段对比正常组织进行观测。在肿瘤细胞植入后第1、3、8和14天进行活体显微镜检查。第1天观察位于植入肿瘤细胞边缘的宿主扭曲、轻度扩张的血管生成性血管；第3天观察肿瘤间质内新形成的肿瘤血管；第8和第14天观察已建立的血管化良好的肿瘤微循环。对照组在同一时间点观察肿瘤-free皮窗中的毛细血管后微静脉。每组每个观测日包含6只动物。所有被研究的微血管直径控制在18至25微米之间，并确保血流连续。每只动物每个实验观察6到8条微血管。
第二系列实验旨在评估肿瘤微血管的内皮受刺激后是否可诱导血小板相互作用。在肿瘤细胞植入第14天，对LLC-1（n=6）、BFS-1（n=6）及对照组（n=6）进行基线测量后，取下皮窗盖玻片，向组织表面超融合钙离子载体A23187（30微升20 μM溶液，持续15分钟），更换新盖玻片后立即进行重复的活体显微镜观察。
所有数据以中位数±标准误（median ± standard error of the median）表示。采用Kruskal-Wallis检验及Dunn方法进行组间比较，用Wilcoxon检验进行组内比较，以P < 0.05为差异有显著性。
主要研究结果
一、肿瘤生长过程中的微血流动力学参数
研究结果显示，两种肿瘤微血管中红细胞流速（RBC velocity）普遍低于对照组的毛细血管后微静脉。LLC-1肿瘤在第1、3、8天流速值显著低于对照组；至第14天虽有所升高，但仍弱于对照。BFS-1肿瘤在第3天出现过一过性流速增快，但此后未持续。因所有被测血管直径相似（约18-25微米），由直径和流速计算所得的管壁剪切率表现出与红细胞流速一致的变化趋势：肿瘤微血管的剪切率降低，其中LLC-1肿瘤在第1、3和8天，以及BFS-1肿瘤在第1和3天，剪切率均显著低于正常组织微血管。
二、肿瘤生长过程中的血小板-内皮相互作用
在正常皮下组织的毛细血管后微静脉中，血小板沿内皮层的滚动维持在一个较低的基线水平上，这一状况在14天观察期内保持恒定。
在肿瘤血管生成早期，LLC-1和BFS-1两组的血小板与微血管内皮相互作用略有增强。肿瘤细胞植入第1天，与对照组相比（1.7 ± 0.6 [1/mm/s]），LLC-1（3.4 ± 1.8）和BFS-1（3.0 ± 0.7）肿瘤细胞附近的宿主血管中血小板滚动数量均显著增加。至第3天，LLC-1肿瘤新生微血管中滚动血小板数量仍显著增高（4.1 ± 1.7），但BFS-1肿瘤（2.3 ± 0.5）和对照组（1.6 ± 0.6）中未见显著增强。然而，这种增强效应是短暂的。到第8天和第14天，两种高度血管化的肿瘤内部，其微血管内皮上的血小板滚动已降至与正常对照组相似的低水平范围，即LLC-1和BFS-1肿瘤与对照组间不再有显著差异。
在为期14天的整个观察期内，无论是处于血管生成中的宿主血管、新形成的肿瘤血管，还是正常组织的毛细血管后微静脉，均未观察到血小板黏附（adherence）现象的发生。
三、钙离子载体A23187对微血流动力学的影响
超融合钙离子载体A23187 15分钟后，无论是正常组织还是肿瘤组织，其微血流动力学参数均未发生显著性改变。为保持可比性，各组织均测量直径相近的微血管。在两组血管化程度高的肿瘤中，红细胞流速仍低于对照组毛细血管后微静脉；其中LLC-1肿瘤在A23187处理后呈现红细胞流速进一步下降的趋势，但无统计学意义。因此，处理后LLC-1肿瘤微血管的管壁剪切率轻度降低，BFS-1和正常组织剪切率则维持基线水平。无论在基线状态还是处理后，正常组织微血管的红细胞流速和管壁剪切率均持续高于两种肿瘤组织。
四、钙离子载体A23187对血小板相互作用的影响
在A23187超融合前，无论是正常还是肿瘤微血管，血小板滚动均处于低基线水平，组间无差异。
A23187处理后的效应呈现明显异质性。对照组的正常毛细血管后微静脉反应最为强烈，血小板滚动数量大约增加3倍（由基线水平升至4.9 ± 0.9 [1/mm/s]）。LLC-1肿瘤微血管也出现轻度的血小板滚动增多，约增至基线的2倍（达2.1 ± 0.4 [1/mm/s]），但在统计学上仍显著低于对照组的增强幅度（P < 0.05）。而BFS-1肿瘤微血管对A23187刺激几乎完全无反应，滚动血小板数量维持在1.8 ± 0.8 [1/mm/s]，与基线相比无明显变化。
在血小板黏附方面，A23187刺激仅偶见于个别实验动物。对照组中有2只动物的毛细血管后微静脉出现较强黏附，而LLC-1和BFS-1肿瘤组中各有1只动物仅在肿瘤微血管中观察到微弱黏附，整体黏附现象零星且肿瘤内黏附强度远逊于正常组织。
结论
基于两项体内实验肿瘤模型，本研究得出以下结论：（1）肿瘤细胞植入后，血小板滚动的轻度增加是一个短暂现象，局限于肿瘤生长的最早期阶段，即仅在与肿瘤细胞紧邻的微血管中一过性出现；（2）已建立血管的肿瘤微血管在面对内皮刺激时，其促进血小板与内皮相互作用的能力显著降低。这种“血小板-内皮相互作用减弱”的现象，可能因肿瘤微血管内皮细胞内的Weibel-Palade小体（内皮细胞特异性储存颗粒）释放P-选择素（P-selectin）和血管性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）的能力不足所致，其原因可能与血管生成因子（特别是高浓度VEGF）的持续作用导致储存颗粒持续分泌而过度消耗，或抑制了黏附分子的从头合成有关。从而，肿瘤微循环不仅对免疫细胞呈“无能应答”状态，对血小板的募集功能也可能同样减弱。
研究亮点
本研究的创新性和价值主要体现在以下几个方面：其一，首次在体内直接可视化和定量分析了实体瘤生长全过程中血小板与微血管内皮的互动动态，颠覆了既往“肿瘤微循环因高促凝环境而吸引血小板聚集”的假设。其二，技术上采用改良的CFDA-SE血小板长期荧光标记法，结合背侧皮褶窗模型和双通道活体荧光显微镜系统，可在无需二次手术的状态下对同一微血管段进行长达14天的重复精确定量观测，该方法保证了数据的连续性、可比性及较高的时空分辨率。其三，通过钙离子载体A23187刺激实验，从功能学角度揭示了肿瘤血管内皮对应激的“低反应性”或“无能状态”，为解释抗血管生成治疗可能加重肿瘤局部循环的炎症细胞/血小板排斥提供了机理层面的认知。其四，该研究将止血系统、炎症反应和血管生成三个看似独立的生物学过程置于同一体内体系下进行关联分析，强调了肿瘤微血管功能重塑的复杂性——即肿瘤在诱导新生血管的同时，也重塑了其表面黏附特性，使其与循环血细胞的交互模式迥异于正常组织。
该工作对于理解肿瘤微循环的独特血管生物学特征，以及某些抗凝或抗血小板策略在肿瘤治疗中的潜在局限性，具有重要的科研启示价值。