本研究由Yu Lina、Zhu Guanxiong、Zhang Zeyu等人共同完成，其中前三者为共同第一作者。通讯作者为Zhang Lingmin和Liang Lu，分别来自广州医科大学附属口腔医院预防口腔科和广州医科大学药学院。该研究发表于《International Journal of Nanomedicine》2023年第18卷，第6185至6198页，于2023年11月1日正式刊出。
口腔癌中最常见的类型——舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）具有预后差、易发生淋巴转移和局部复发率高的特点。目前常规治疗方案为手术切除后辅以放疗和化疗，但近些年来患者的五年总生存率并未获得显著提升，因此亟需开发更为精准和个体化的治疗策略。
光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）作为一种新兴的癌症治疗手段，通过光敏剂在特定波长光照下产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），从而对肿瘤细胞造成局部杀伤。维替泊芬（verteporfin）是一种经美国FDA批准的光敏剂，临床上主要用于年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）的治疗。近年来临床前研究发现维替泊芬在肝癌、胰腺癌、胃癌及头颈部肿瘤中具有潜在抗癌价值，但在口腔癌治疗中的应用报道极为少见。
金属有机框架（metal-organic frameworks，MOFs）是由金属阳离子与有机桥联配体组合而成的杂化材料。其中沸石咪唑酯骨架8（zeolitic imidazolate framework 8，ZIF-8）因其良好的热稳定性和较低的毒性，在药物递送领域备受关注。ZIF-8在水性环境中具有生物可降解性和可控释放特性，但这一特点也可能导致药物在到达靶点之前发生泄漏。
生物仿生纳米颗粒通过将天然细胞膜包裹在纳米颗粒表面，可以增强靶向药物递送能力。巨噬细胞作为免疫细胞，在肿瘤免疫调节中发挥重要作用。利用巨噬细胞膜包裹纳米颗粒，可以模拟巨噬细胞的特性，从而延长体内循环时间、减少免疫监视清除，并增强肿瘤归巢能力。
基于以上背景，本研究旨在构建一种以M1型巨噬细胞膜伪装ZIF-8负载维替泊芬的仿生纳米光敏剂，以期增强药物在体内的循环寿命和对口腔癌细胞的靶向特异性，从而实现高效的光动力治疗。
首先，研究者采用“一锅法”合成ZIF-8@Ver：将维替泊芬（2 mg/mL）溶解于含2-甲基咪唑（200 mg/mL）的甲醇溶液中，搅拌10分钟后加入六水合硝酸锌（100 mg/mL），室温避光搅拌1小时，离心收集产物。随后，从M1型巨噬细胞中提取细胞膜，将M1巨噬细胞膜与ZIF-8@Ver按5:1的质量比混合，经过5分钟超声处理和挤出工艺，制备获得ZIF-8@Ver-M1M。
纳米颗粒表征包括：利用透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察形貌；使用Nano ZS仪器检测粒径、多分散指数（polydispersity index，PDI）和Zeta电位；通过SDS-PAGE分析巨噬细胞膜蛋白的保留情况；采用紫外-可见分光光度法测定维替泊芬的包封率和载药量。
细胞实验使用人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞系和小鼠巨噬细胞RAW 264.7细胞系。细胞摄取研究方面，将CAL-27细胞与不同浓度（1、2、3、4、5 μg/mL）的ZIF-8@Ver-M1M孵育不同时间（1、2、4、6、8小时），通过共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy，CLSM）和流式细胞术（flow cytometry，FACS）评估纳米颗粒的细胞摄取动力学和剂量依赖性。溶酶体逃逸实验中，细胞用Lyso-Tracker Blue DND-22染色后，在1小时和4小时时间点用CLSM观察纳米颗粒（红色荧光）与溶酶体（蓝色荧光）的共定位情况。
活性氧检测方面，CAL-27细胞分别接受PBS、维替泊芬+激光、ZIF-8@Ver+激光和ZIF-8@Ver-M1M+激光处理4小时，加入DCFH-DA探针后，使用660 nm激光（2 W/cm²，5分钟）照射，通过CLSM检测ROS产生。细胞毒性评估采用CCK-8法和Calcein-AM/PI活死细胞染色法，比较不同处理组对CAL-27细胞的杀伤效果。
动物实验经广州医科大学实验动物伦理委员会批准（编号S2023-511）。使用30只5–6周龄雌性BALB/c裸鼠（体重约18–22 g），随机分为6组（每组5只）：PBS组、维替泊芬组、ZIF-8@Ver组、ZIF-8@Ver-M1M组、ZIF-8@Ver+激光组和ZIF-8@Ver-M1M+激光组。通过皮下注射CAL-27细胞建立肿瘤模型，待肿瘤体积达到150 mm³后开始治疗。制剂通过局部注射给药，每2天一次，共治疗20天。激光组在给药后接受660 nm激光照射（2 W/cm²，5分钟）。每2天测量肿瘤体积。治疗结束后处死小鼠，取出肿瘤和主要器官进行称重、苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）、Ki-67免疫组织化学染色和TUNEL凋亡检测。
体内生物分布研究方面，将荧光标记的维替泊芬、ZIF-8@Ver或ZIF-8@Ver-M1M局部注射至荷瘤小鼠，在给药后1、2、4、8、12、24和48小时使用小动物活体成像系统（IVIS Lumina LT）进行成像，并在实验终点对主要器官进行离体成像。药物释放实验使用截留分子量为3500 Da的透析袋，在pH 7.4和pH 5.4两种条件下考察ZIF-8@Ver-M1M的累计释放曲线。
TEM图像显示ZIF-8和ZIF-8@Ver呈现菱形十二面体三维结构，边缘清晰锐利。而ZIF-8@Ver-M1M的形貌则变得不规则，棱角模糊，表明巨噬细胞膜成功包覆。粒径分析显示ZIF-8、ZIF-8@Ver和ZIF-8@Ver-M1M的平均粒径分别为186.4±5.8 nm、192.6±2.3 nm和210±8.3 nm。Zeta电位测定显示，ZIF-8的电位为26.2 mV，负载维替泊芬后升至35.6 mV，而经巨噬细胞膜包覆后电位降至−20.3±5.6 mV，这一电位翻转进一步证实了膜包覆的成功。包封率优化实验中，ZIF-8与维替泊芬的质量比为100时获得近60%的包封效率。SDS-PAGE分析证明ZIF-8@Ver-M1M保留了巨噬细胞膜的大部分蛋白质组分。
CLSM和FACS分析表明，ZIF-8@Ver-M1M在CAL-27细胞中的摄取呈现时间和剂量依赖性：随着孵育时间从1小时延长至8小时，细胞内荧光强度显著增加；随着纳米颗粒浓度从1 μg/mL提高至5 μg/mL，细胞内荧光信号也逐步增强。溶酶体逃逸实验中，1小时时间点红色荧光（纳米颗粒）与蓝色荧光（溶酶体）高度重叠，说明纳米颗粒主要位于溶酶体内；4小时后两种荧光的共定位明显减少，提示大量纳米颗粒已成功从溶酶体逃逸。这一溶酶体逃逸能力对于维替泊芬的有效释放和后续光动力效应的发挥至关重要。
CCK-8实验显示，ZIF-8@Ver+激光和ZIF-8@Ver-M1M+激光处理后CAL-27细胞活力显著下降，且ZIF-8@Ver-M1M+激光组的细胞毒性强于ZIF-8@Ver+激光组。活死细胞染色结果一致：ZIF-8@Ver-M1M+激光组呈现大量红色荧光（死细胞），而绿色荧光（活细胞）显著减少。ROS检测显示，ZIF-8@Ver-M1M+激光组的细胞内ROS水平明显高于其他各组，证实了光动力效应的高效触发。
活体成像显示，ZIF-8@Ver-M1M在肿瘤部位的荧光信号显著强于游离维替泊芬和未包膜的ZIF-8@Ver，且随时间延长在肿瘤组织中表现出优先蓄积。离体器官成像进一步证实，纳米颗粒主要分布在肿瘤，在心、肝、肺、脾、肾等主要器官中的荧光信号极低。药物释放实验表明，在pH 7.4的中性环境下维替泊芬呈现持续缓慢释放特征；而在pH 5.4的酸性环境中药物释放速度显著加快。这一pH响应性释放行为有利于纳米颗粒在酸性肿瘤微环境中快速释放药物，而在正常生理环境中保持稳定。
肿瘤体积监测数据显示，无激光处理的维替泊芬、ZIF-8@Ver和ZIF-8@Ver-M1M组均未表现出明显的肿瘤生长抑制作用。而ZIF-8@Ver+激光和ZIF-8@Ver-M1M+激光组均能有效抑制肿瘤生长，其中ZIF-8@Ver-M1M+激光组的抑瘤效果最为显著，优于未包膜的ZIF-8@Ver+激光组。肿瘤重量测量结果与体积数据一致。各组小鼠体重在治疗期间均未发生显著变化，提示纳米制剂无明显全身毒性。
组织学分析显示，ZIF-8@Ver-M1M+激光组的肿瘤组织中出现大量坏死区域，而对照组坏死极少。Ki-67免疫组化染色显示ZIF-8@Ver-M1M+激光组肿瘤细胞增殖指数显著降低。TUNEL检测结果表明该组凋亡细胞比例明显高于未照射组。主要器官HE染色未发现明显组织学改变，证实了纳米制剂良好的体内生物安全性。
本研究成功构建了一种以M1型巨噬细胞膜伪装的ZIF-8基纳米光敏剂用于维替泊芬的靶向递送。巨噬细胞膜包覆赋予了纳米颗粒多重优势：通过整合素α4β1与肿瘤细胞表面血管细胞黏附分子-1（vascular cell-adhesion molecule 1，VCAM-1）的相互作用实现对肿瘤细胞的主动靶向；通过免疫伪装延长体内循环时间、减少免疫清除；ZIF-8的pH响应性降解特性实现了药物的肿瘤微环境控释。体外和体内实验均证实该纳米体系在激光照射下能高效产生ROS、诱导肿瘤细胞凋亡，同时具备良好的生物安全性。
该研究为口腔癌的光动力治疗提供了一种创新的纳米递送策略，展示了维替泊芬在口腔癌治疗中的应用潜力。通过将PDT的细胞毒性效应与巨噬细胞膜介导的免疫调节功能相结合，该纳米体系有望实现协同抗癌效果，为临床口腔癌治疗提供了新的思路和实验依据。
本研究的创新性主要体现在以下几个方面：第一，首次将临床已批准的维替泊芬以ZIF-8纳米载体的形式应用于口腔癌的光动力治疗，填补了该领域的研究空白；第二，采用M1型巨噬细胞膜伪装纳米颗粒，实现了主动肿瘤靶向与免疫逃逸的双重功能，显著提高了药物在肿瘤部位的蓄积；第三，利用ZIF-8的pH响应性降解特性，实现了药物在酸性肿瘤微环境中的选择性释放；第四，通过纳米递送策略克服了游离维替泊芬水溶性差、肿瘤靶向性不足的局限性，为疏水性光敏剂的临床应用提供了新的技术路径。