关于卵形拟杆菌来源的N-甲基血清素通过HTR1D介导的cAMP-PKA-NF-κB信号轴抑制结直肠癌的研究报告
一、 研究作者、机构与发表信息 本研究由贺吉凯、贾佳琪、曲文浩、张书语、范珂宇、林润泽、赵威、牛艳、黄艳强、贾立周共同完成。作者单位包括右江民族医学院研究生院（中国百色）、织金县人民医院检验科（中国毕节）、罗切斯特大学文理学院（美国罗切斯特）、北京大学人民医院麻醉科（中国北京）、苏州大学医学部放射医学与防护学院（中国苏州）、内蒙古医科大学（中国呼和浩特）以及巴彦淖尔市医院中心实验室（中国巴彦淖尔）。该研究作为原创性研究论文，于2025年11月24日发表在开放获取期刊《Frontiers in Immunology》上，文章标题为“Bacteroides ovatus-derived N-methylserotonin inhibit colorectal cancer via the HTR1D-mediated cAMP-PKA-NF-κB signaling axis”。
二、 学术背景与研究目的 结直肠癌（Colorectal Cancer， CRC）是全球范围内最常见、死亡率最高的恶性肿瘤之一。近年来，肠道菌群及其代谢产物在CRC的发生、发展、诊断、治疗及预后中的关键作用日益受到关注。这些微生物及其代谢物不仅维持肠道稳态、保护黏膜完整性，还能增强免疫功能、调节物质代谢。因此，识别新型的有益代谢物和益生菌对于CRC的防治具有重要意义。
卵形拟杆菌（Bacteroides ovatus， B. ovatus）被鉴定为能有效分解柑橘纤维释放N-甲基血清素（N-methylserotonin， NMS）的肠道菌种。NMS是一种存在于植物和哺乳动物体内的内源性物质，前期研究表明其具有调节代谢、改善肥胖、影响肠道转运和昼夜节律基因表达等潜在益处。然而，B. ovatus及其代谢产物NMS在癌症，特别是CRC中的作用尚未有报道。同时，血清素受体，尤其是5-羟色胺受体1D（HTR1D），在CRC中高表达且与不良预后相关，但其具体作用机制以及与菌群代谢物的关联尚不明确。
基于此，本研究旨在：1）分析健康人群与CRC患者肠道菌群组成、代谢物及代谢通路的差异；2）验证B. ovatus利用柑橘纤维产生NMS的能力；3）探究B. ovatus来源的NMS对CRC进展的抑制作用；4）阐明其抑制CRC的潜在分子机制。
三、 详细研究流程 本研究包含五个主要部分，采用了多组学联用、细胞与动物模型、生物信息学及分子生物学验证相结合的综合策略。
第一部分：人群队列的宏基因组学与非靶向代谢组学分析 * 研究对象：收集了2021年7月至2022年12月期间在内蒙古巴彦淖尔市医院确诊的26名CRC患者以及20名健康对照（H）的粪便样本。所有患者均为初诊，未接受过放疗、化疗或手术治疗，并排除了其他肠道相关疾病及近期抗生素/益生菌使用史。 * 实验方法： 1. 宏基因组测序：提取粪便总DNA，进行高通量测序。对原始数据进行质控、去宿主序列、组装和基因预测。将预测的编码序列（CDS）去冗余后获得非冗余基因集（Unigenes），并与NR、GO、KEGG数据库进行比对，获得物种注释和功能注释信息，计算基因丰度。 2. 非靶向代谢组学分析：使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术检测粪便代谢物。通过高分辨率质谱仪Q-Exactive在正负离子模式下采集数据，将原始数据转换为可读格式后，与自建标准品数据库进行比对和注释，鉴定并定量代谢物。 * 数据分析：使用Wilcoxon检验进行α多样性（Chao1， Shannon指数）和组间差异分析；基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）评估β多样性；使用LEfSe分析寻找组间显著差异的物种；利用随机森林（Random Forest）模型结合逻辑回归，筛选并构建基于差异菌种和代谢物的CRC诊断模型；采用Spearman相关性分析探究差异菌属、差异代谢物与差异KO基因之间的关联。
第二部分：体外与体内验证B. ovatus产NMS能力 * 研究对象与方法： 1. 体外验证：将B. ovatus（ATCC 8483）菌悬液分为B. ovatus单独培养组、B. ovatus与柑橘纤维共培养组，以及柑橘纤维单独对照组。在厌氧条件下培养72小时后，通过靶向代谢组学方法定量培养上清液中的NMS水平。 2. 体内验证：使用9周龄SPF级C57BL/6J小鼠，分为四组：标准饲料组、单独灌胃B. ovatus组、饮用水中添加柑橘纤维组、B. ovatus与柑橘纤维联合干预组。干预7天后，收集粪便样本，检测其中NMS含量。
第三部分：NMS对CRC细胞恶性表型的体外抑制作用 * 研究对象：人正常结肠上皮细胞（NCM460）、人CRC细胞系（HCT116， HT29）和小鼠CRC细胞系（CT26.WT）。 * 实验方法： 1. 细胞增殖实验：使用CCK-8试剂盒检测不同浓度NMS处理48小时后对细胞活力的影响，并计算半数抑制浓度（IC50）。 2. 克隆形成实验：将细胞接种于6孔板，用含1 mM NMS的培养基处理两周后，固定染色，计数克隆数。 3. 迁移与侵袭实验：采用划痕实验检测NMS对细胞迁移能力的影响；使用Transwell小室（辅以Matrigel胶模拟基底膜）检测NMS对细胞侵袭能力的影响。 4. 细胞周期与凋亡实验：使用流式细胞术检测NMS处理48小时后对细胞周期分布（PI染色）和细胞凋亡率（Annexin V-FITC/PI双染）的影响。
第四部分：B. ovatus来源的NMS在AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型中的治疗效果 * 动物模型建立：使用SPF级C57BL/6小鼠，通过腹腔注射氧化偶氮甲烷（AOM）结合饮用葡聚糖硫酸钠（DSS）水循环诱导炎症相关的CRC模型。 * 实验分组：分为对照组、AOM/DSS模型组、以及四个治疗组：单独柑橘纤维组、单独B. ovatus灌胃组、B. ovatus与柑橘纤维联合组、单独NMS注射组。 * 观察与检测指标： 1. 表型观察：定期监测小鼠体重、生存率、直肠出血情况，计算疾病活动指数（DAI）。 2. 终点分析：实验第12周处死小鼠，测量结直肠长度、计数肿瘤数目、计算肝脾指数。 3. 组织学分析：结直肠组织进行苏木精-伊红（H&E）染色评估病理变化；通过免疫组化（IHC）检测细胞增殖标志物Ki-67和紧密连接蛋白Occludin的表达水平。 4. 血清检测：使用ELISA法检测血清脂多糖（LPS）水平，评估肠道屏障功能。 5. 肠道菌群与代谢物分析：收集各组小鼠粪便，进行16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学分析，评估干预对肠道微生态的影响。
第五部分：NMS抑制CRC的分子机制探究 * 网络药理学与分子对接： 1. 从PubChem数据库获取NMS的化学结构，利用SwissTargetPrediction平台预测其潜在作用靶点。 2. 从GeneCards数据库以“colorectal cancer”为关键词检索CRC相关基因。 3. 取NMS预测靶点与CRC相关基因的交集，通过DAVID数据库进行基因本体（GO）和KEGG通路富集分析。 4. 使用分子对接软件模拟NMS与关键靶点蛋白HTR1D的结合模式，计算结合能。 * 蛋白质印迹（Western Blot）验证： 1. 提取小鼠结直肠组织蛋白。 2. 使用Western Blot技术检测以下关键信号通路蛋白的表达水平：HTR1D、环磷酸腺苷（cAMP）、磷酸化蛋白激酶A（p-PKA）、磷酸化核因子κB抑制蛋白α（p-IκBα）、磷酸化核因子κB（p-NF-κB），以及下游细胞因子p53。
四、 主要研究结果 1. CRC患者肠道菌群与代谢特征： α多样性分析显示CRC组与健康组无显著差异，但β多样性存在显著区别，表明CRC的发生与特定菌群结构改变而非整体多样性下降有关。与健康组相比，CRC患者肠道中埃希氏菌属（Escherichia）、梭杆菌属（Fusobacterium）、克雷伯菌属（Klebsiella）等潜在致病菌丰度升高，而乳球菌属（Lactococcus）、毛螺菌属（Lachnospira）等有益菌丰度降低。代谢组学显示，CRC患者体内NMS、D-半乳糖醛酸、花生四烯酸等代谢物水平显著降低，而胆固醇、亚油酸降解产物等水平升高。通路分析发现，CRC组中糖酵解、甲烷代谢、有益氨基酸降解等通路显著上调，而NMS合成、亚油酸代谢等通路下调。相关性分析证实，B. ovatus的丰度与粪便NMS水平呈显著正相关。诊断模型显示，结合特定差异菌种（如具核梭杆菌）和NMS，可将CRC与健康人区分的曲线下面积（AUC）提高至0.994。
2. B. ovatus代谢柑橘纤维产NMS的验证： 体外培养实验证实，只有B. ovatus与柑橘纤维共培养时，上清液中才能检测到高水平的NMS。体内小鼠实验同样表明，只有同时给予B. ovatus和柑橘纤维的小鼠粪便中NMS含量显著升高。这确证了B. ovatus具有将膳食柑橘纤维转化为NMS的独特代谢能力。
3. NMS在体外抑制CRC细胞恶性生物学行为： CCK-8和克隆形成实验表明，NMS能以剂量依赖的方式显著抑制HCT116、HT29和CT26.WT三种CRC细胞的增殖活力，而对正常结肠上皮细胞NCM460的毒性较低。划痕实验和Transwell侵袭实验显示，NMS能有效抑制CRC细胞的迁移和侵袭能力。流式细胞术结果显示，NMS处理可将CRC细胞阻滞在G1期，并显著诱导细胞凋亡。这些作用在NCM460细胞中均未观察到，提示NMS对CRC细胞具有选择性抑制作用。
4. B. ovatus/NMS在体内抑制CRC发生发展： 在AOM/DSS诱导的CRC小鼠模型中，与模型组相比，B. ovatus联合柑橘纤维干预组（BF组）和单独NMS治疗组（N组）能显著改善小鼠体重下降、降低DAI评分、提高生存率、恢复结直肠长度、减少肿瘤数量并减轻肝脾肿大。组织学分析显示，BF组和N组小鼠结直肠病变程度更轻，多为黏膜内癌或高级别上皮内瘤变。免疫组化结果表明，NMS治疗能最有效地抑制肿瘤增殖标志物Ki-67的表达，同时上调紧密连接蛋白Occludin的表达。血清LPS水平在NMS治疗后显著下降，提示肠道屏障功能得到改善。
5. NMS抑制CRC的分子机制： 网络药理学分析预测NMS可能通过作用于5-羟色胺受体并影响cAMP信号通路等发挥作用。分子对接显示NMS与HTR1D具有较高的结合亲和力（结合能为-6.4 kcal/mol）。Western Blot实验验证了这一机制：在AOM/DSS模型组小鼠结直肠组织中，HTR1D、cAMP、p-PKA、p-IκBα和p-NF-κB的表达均显著上调。而经柑橘纤维、BF联合干预或NMS治疗后，这些蛋白的表达水平被显著抑制，其中NMS和BF联合组的效果最为明显。同时，这些治疗还逆转了模型组中p53蛋白的下调。这表明NMS可能通过下调HTR1D的表达，进而抑制其下游的cAMP/PKA信号通路，减少IκBα的磷酸化与降解，最终阻止NF-κB的核转位和激活，并调节p53等下游因子，从而发挥抗CRC作用。
6. 干预措施对肠道微生态的重塑： 16S rRNA测序和代谢组学分析显示，BF和NMS治疗能优化AOM/DSS模型小鼠紊乱的肠道菌群结构，增加双歧杆菌属（Bifidobacterium）、优杆菌属（Eubacterium_xylanophilum_group）等有益菌的丰度，并改变相关的代谢物谱。KEGG富集分析提示，干预后差异菌群和代谢物涉及的通路包括细胞凋亡、碳水化合物代谢、cAMP信号通路、酪氨酸代谢等，这可能与治疗效果相关。
五、 研究结论与价值 本研究首次系统性地揭示了卵形拟杆菌（B. ovatus）及其代谢产物N-甲基血清素（NMS）在结直肠癌（CRC）防治中的关键作用。结论如下： 1. CRC患者肠道内B. ovatus丰度和NMS水平显著降低，且两者正相关。 2. B. ovatus能够特异性代谢柑橘纤维产生NMS。 3. NMS在体外能有效抑制CRC细胞的增殖、迁移、侵袭，诱导细胞周期阻滞和凋亡。 4. 在体内，补充B. ovatus（联合柑橘纤维）或直接给予NMS，能显著减轻AOM/DSS诱导的小鼠CRC发生发展，改善肠道屏障功能。 5. 其分子机制可能是通过下调HTR1D受体，抑制cAMP/PKA/IκBα/NF-κB信号通路的过度激活，并调节p53等下游因子来实现的。 6. 该疗法还能优化肠道菌群结构和代谢组成。
科学价值：本研究不仅发现了一种由特定肠道细菌（B. ovatus）利用膳食纤维（柑橘纤维）产生的新型潜在抗癌代谢物（NMS），还首次阐明了其通过HTR1D/cAMP/PKA/NF-κB轴抑制CRC的分子机制。这为理解“肠道菌群-代谢物-宿主信号轴”在肿瘤微环境中的作用提供了全新视角。
应用价值：该研究为CRC的预防和治疗提供了新的策略和靶点。通过膳食补充富含特定纤维（如柑橘纤维）或直接补充B. ovatus益生菌，有望在体内提升NMS水平，从而预防或辅助治疗CRC。NMS本身或其类似物也可能被开发为新型抗癌药物或先导化合物。
六、 研究亮点 1. 创新性的发现：首次将B. ovatus、其膳食底物柑橘纤维、代谢产物NMS与CRC的抑制效应联系起来，构建了一个完整的“益生菌-益生元-有益代谢物”功能轴。 2. 多维度证据链：研究结合了人群队列多组学分析、体外细菌代谢验证、细胞功能实验、动物模型表型与机制探索，以及生物信息学预测与分子生物学验证，证据充分，逻辑严谨。 3. 机制深度挖掘：不仅证明了NMS的抗癌表型，还深入揭示了其作用于HTR1D受体，进而调控经典的cAMP/PKA/NF-κB信号通路的具体分子机制，将微生物代谢与宿主细胞内信号传导直接挂钩。 4. 转化潜力明确：研究结果直接指向了通过饮食调节（补充柑橘纤维）或微生物干预（补充B. ovatus）来提升内源性抗癌代谢物水平的预防和治疗策略，具有明确的临床转化前景。 5. 诊断价值提示：研究发现B. ovatus丰度和NMS水平可作为潜在的CRC诊断生物标志物，为无创诊断提供了新思路。
七、 其他有价值内容 研究也指出了自身的局限性，如人类样本量较小、患者TNM分期分布不均衡、以及机制上缺乏HTR1D基因操作（如过表达或敲低）或特异性激动剂/拮抗剂的直接因果验证。作者表示，扩大样本量、建立多中心纵向队列以及进行更深入的机制验证是未来研究的重点。尽管如此，该研究率先揭示了B. ovatus来源的NMS在CRC抑制中的作用，为基于肠道菌群的CRC治疗策略开辟了新的道路。