本研究由Ziqi Huang、Yip Ming Tsun、Chao Liang等学者合作完成，主要研究机构包括香港大学牙医学院生物功能材料部、香港大学李嘉诚医学院生物医学学院以及德国癌症研究中心等。通讯作者为Rio Ryohichi Sugimura和Sang Jin Lee。该论文发表于《advanced composites and hybrid materials》期刊，2025年第8卷，文章编号376。

该研究属于生物材料与肿瘤免疫治疗交叉领域。癌症模型在动物研究中具有核心地位，尤其是血管化肿瘤组织对于验证免疫细胞疗法至关重要。然而，仅依赖癌细胞构建的异种移植模型往往无法有效形成肿瘤组织；而利用水凝胶包裹癌细胞促进血管化的策略又常常残留生物材料，抑制其与周围组织的整合。针对这些问题，研究者提出利用完全可降解、无交联剂的羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan, cmcts）/氧化透明质酸（oxidized hyaluronic acid, oha）水凝胶原位注射包载高密度人源癌细胞，以实现体内血管化肿瘤模型的简单构建。该研究的核心目的是验证该水凝胶能否在小鼠体内快速降解、能否自发形成肿瘤模型、能否建立稳健的血管网络并形成致密实体瘤，以及能否用于评估免疫细胞治疗的潜在效果。研究采用的主要材料为高密度人肝癌细胞HepG2和Huh-7，通过将细胞与水凝胶混合后皮下注射至免疫缺陷小鼠体内，观察肿瘤形成、血管化以及后续免疫细胞浸润情况。

实验流程主要包括材料制备与表征、体外三维细胞培养、体内肿瘤模型构建以及免疫细胞治疗评估四大部分。首先，oha通过高碘酸钠氧化裂解透明质酸的邻二醇结构生成双醛基，随后与cmcts的氨基发生席夫碱反应形成原位水凝胶。通过核磁共振氢谱确认了醛基的存在，傅里叶变换红外光谱显示1730 cm⁻¹处醛基峰消失，1590 cm⁻¹处出现动态亚胺键特征峰，证明cmcts与oha成功交联。体外降解实验表明，水凝胶在磷酸盐缓冲液中21天内完全降解，24小时内降解率已达30%。流变学测试显示水凝胶具有弱凝胶行为，储能模量在低频下高于损耗模量，且包载细胞后力学强度略有下降但不影响注射性。体外培养实验中，HepG2和Huh-7细胞以1.5×10⁸个/ml的密度与水凝胶混合后，在培养第1天即开始自发凝集，第7天形成致密的三维细胞聚集体，苏木精-伊红染色、F-肌动蛋白染色与活/死染色均证实细胞活性良好且紧密连接。体内实验部分，研究者将细胞负载水凝胶皮下注射至BALB/c、SCID和NSG小鼠体内，设置PBS和Matrigel®对照组。注射后1周、2周和4周取材进行组织学分析。BALB/c小鼠中，移植后1周水凝胶完全消失，移植细胞与宿主组织紧密整合，但未观察到广泛的肿瘤生长，这主要归因于免疫系统对人源细胞的排斥。SCID小鼠中，注射后2周观察到实体瘤形成，H&E、阿尔辛蓝、番红O/固绿染色显示肿瘤细胞形成大量簇状结构，核质比高，核形态不规则，确认肿瘤成功建立，且未发现水凝胶残留。值得注意的是，所有染色中均观察到“血湖”样结构，即红细胞聚集成团，提示血管样结构的形成。免疫荧光染色进一步显示Glypican-3阳性肿瘤组织内存在CD31阳性的血管结构，血管源自宿主组织并浸润实体瘤。血管量化分析比较了cmcts/oha水凝胶、PBS和Matrigel®对照组：cmcts/oha组的血管数量和面积均显著优于PBS组；与Matrigel®组相比，cmcts/oha组在HepG2细胞中血管数量和面积更优，而Huh-7细胞在Matrigel®中血管形成相对增加，但Matrigel®残留物明显阻碍了血管浸润和组织整合。4周取材结果显示肿瘤与宿主肌肉组织紧密整合，新血管与肿瘤交织，CD31免疫荧光显示血管管腔结构在实体瘤内强烈形成。免疫细胞治疗评估中，研究者通过尾静脉注射人源巨噬细胞，发现与PBS对照组相比，巨噬细胞注射组小鼠肿瘤内CD45阳性免疫细胞数量增加超过两倍。H&E染色显示巨噬细胞定位于肿瘤血管周围，免疫荧光检测到小鼠F4/80阳性巨噬细胞紧邻CD31阳性血管结构，证实该血管化肿瘤模型能够支持过继性免疫细胞的循环、迁移和肿瘤内浸润。

研究结论表明，cmcts/oha水凝胶具有优异的可注射性和生物相容性，注射后无显著不良反应。水凝胶在皮下注射后2周内完全降解，释放的癌细胞在注射部位聚集形成实体瘤，并与周围天然组织紧密整合。注射后4周，实体瘤内观察到成熟血管结构。经尾静脉注射的巨噬细胞被发现位于肿瘤内血管附近，说明新生血管具有可灌注性，可作为免疫细胞的运输通道。该研究的科学价值在于提供了一种简单、快速且可靠的血管化人源肿瘤小鼠模型构建策略，避免了传统水凝胶残留抑制组织整合的问题。其应用价值在于为免疫细胞疗法特别是巨噬细胞疗法的验证提供了便捷的平台，有助于评估过继转移细胞在肿瘤微环境中的迁移、空间分布及与肿瘤细胞的相互作用。研究亮点包括：oha通过高碘酸钠氧化制备，促进了cmcts/oha原位水凝胶的形成；该水凝胶在短时间内完全降解，允许三维细胞凝集；高密度细胞负载水凝胶皮下注射后成功生成血管化实体瘤；移植的治疗性细胞经血流被观察到黏附于肿瘤组织。此外，研究还讨论了席夫碱键的动态可逆性赋予水凝胶自愈合和触变性行为，以及降解机制与水分子对亚胺键的水解作用有关。研究的局限性在于缺乏对肿瘤内新生血管的分子特征分析，未与肝细胞癌患者的血管结构进行比较，单细胞RNA测序可能提供更详细的内皮细胞、周细胞和基质细胞表型信息。总体而言，该研究为通过简单注射即可构建完全血管化的小鼠肿瘤模型奠定了基础，对推动基于巨噬细胞的免疫治疗临床应用具有重要意义。