本研究报告针对一种名为RLY-2608的首个同类突变选择性变构PI3Kα抑制剂进行了详细的介绍，包括其发现过程、临床前验证及早期临床概念验证。研究的核心目标是为PIK3CA突变癌症患者提供一种能够有效抑制肿瘤生长，同时避免因抑制野生型（WT）PI3Kα蛋白而导致的高血糖、高胰岛素血症等剂量限制性毒性的新型靶向疗法。
第一作者、主要单位及发表信息 本研究由一支庞大的跨学科团队完成，第一作者为Andreas Varkaris。研究团队来自多个知名机构，包括哈佛医学院麻省总医院癌症中心（Mass General Cancer Center and Department of Medicine, Harvard Medical School）、Relay Therapeutics, Inc.、D. E. Shaw Research、加州大学旧金山分校（University of California San Francisco）、纪念斯隆凯特琳癌症中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center）等。这项研究成果以研究文章的形式发表于美国癌症研究协会的期刊 Cancer Discovery 上，于2024年2月出版（具体发表日期为2023年2月，对应于2024年2月的卷期），论文标题为“Discovery and clinical proof-of-concept of RLY-2608, a first-in-class mutant-selective allosteric PI3Kα inhibitor that decouples antitumor activity from hyperinsulinemia”。
研究的学术背景 1. 科学领域：本研究属于肿瘤靶向治疗领域，具体聚焦于磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase, PI3K）信号通路，特别是其PI3Kα亚型（由PIK3CA基因编码的p110α催化亚基）。 2. 研究动机与背景知识： * PIK3CA突变是重要靶点：PIK3CA是实体瘤中最常发生突变的激酶基因，约14%的实体瘤存在其突变，在激素受体阳性（HR+）、人表皮生长因子受体2阴性（HER2-）乳腺癌中突变率高达40%。这些突变（如激酶结构域的H1047R，螺旋结构域的E542K、E545K）会持续激活PI3Kα通路，驱动肿瘤生长。 * 现有疗法的局限：目前已获批的PI3Kα抑制剂（如Alpelisib）是作用于ATP结合位点的正构抑制剂（orthosteric inhibitor）。它们不具备突变选择性，会同等程度地抑制野生型PI3Kα。而野生型PI3Kα在细胞葡萄糖摄取和胰岛素响应中起着关键作用。因此，使用Alpelisib会导致剂量限制性的高血糖和高胰岛素血症等严重副作用，限制了其临床应用和治疗窗口。 * 结构生物学挑战：此前的研究（X射线晶体学和冷冻电镜）表明，致癌突变（如H1047R）主要通过扰乱p110α催化亚基与p85α调节亚基之间的构象调控来激活激酶，而非直接改变活性位点的结构。这使得开发既具有亚型选择性又具有突变选择性的抑制剂变得极为困难。 3. 研究目标：本研究旨在利用结构生物学、计算模拟和新型筛选技术，发现并开发一种变构的、突变选择性的PI3Kα抑制剂，以期将抗肿瘤活性与高胰岛素血症副作用解耦，为患者提供更安全有效的治疗选择。
研究的详细工作流程 本研究是一个多步骤、多技术平台集成的系统性药物研发项目，其工作流程环环相扣，逻辑严谨。
1. 揭示突变体与野生型PI3Kα的构象差异（结构生物学与计算模拟） * 研究对象与方法： * 冷冻电镜结构解析：研究团队首先解析了全长野生型p85α:p110α异源二聚体在无配体结合状态（apo state）下的高分辨率（2.7 Å）冷冻电镜结构。这为后续分析提供了精确的分子模型。 * 分子动力学模拟：基于上述冷冻电镜结构，研究团队对野生型和H1047R突变型PI3Kα进行了长时间尺度（多轮10微秒及100微秒）的分子动力学模拟。模拟体系包括与p85α结合的复合体，以及单独的p110α激酶结构域，以探究突变对蛋白动态构象的影响。 * X射线晶体学验证：为了进一步比较野生型与突变型在特定晶体环境下的构象，研究团队还获得了野生型和H1047R突变体在另一种同晶型晶体中的结构，以便进行直接比较。 * 数据处理与分析：通过分析模拟轨迹中C末端尾巴（包含H1047/R1047和W1051）、激活环、HRD基序以及F954等关键区域的均方根偏差和构象采样，并与冷冻电镜、X射线结构数据进行比对和整合，构建了突变激活的构象模型。
2. 突变选择性小分子的发现（DNA编码库筛选） * 研究对象：研究团队使用经过冷冻电镜验证的全长PI3Kα蛋白（野生型、H1047R、E542K和E545K突变体）作为靶标。 * 实验方法与流程： * DNA编码库筛选策略：这是一个关键的创新性筛选步骤。研究团队设计了一种精妙的DNA编码文库筛选方案，其核心优势有三点： 1. 使用全长蛋白（而非截短体），确保筛选能捕捉到与C末端尾巴构象调控相关的化合物。 2. 在筛选体系中加入正构抑制剂，用以“封闭”ATP活性位点，从而富集能够结合在别处的变构抑制剂。 3. 重点筛选那些对H1047R、E542K和E545K突变体的结合富集度显著高于野生型的化合物，以实现突变选择性。 * 初步验证：从DEL筛选中鉴定出的苗头化合物（Hit）被合成出来（脱离DNA标签），并通过表面等离子共振技术评估其结合动力学，通过生化酶活实验评估其抑制活性。
3. 变构结合位点的识别与化合物优化（结构生物学与药物化学） * 研究对象：使用截短了C末端尾巴的PI3Kα蛋白晶体，与化合物共结晶。 * 实验方法与流程： * X射线晶体学：研究团队解析了PI3Kα与初步苗头化合物类似物（溴代化合物[2]）的共晶结构（分辨率2.38 Å）。这清晰揭示了化合物结合在一个由激活环位移形成的“隐秘口袋”中。 * 构效关系与优化：基于共晶结构提供的结合模式信息，研究团队通过自由能微扰计算等计算机辅助药物设计手段，对先导化合物进行结构优化。优化的方向集中在提高对PI3Kα突变体的效力和选择性，以及对其他PI3K亚型（β， γ， δ）的选择性。关键的优化包括将双氨基吡啶核心替换为氨基异吲哚核心，以及对苯环和酰胺侧链进行修饰，最终得到了候选药物RLY-2608。 * 选择性机制验证：通过比较化合物与野生型、截尾突变体、H1047R突变体的结合动力学，并结合结构信息，阐明了选择性源于突变体C末端尾巴的“解离”构象更有利于隐秘口袋的打开，从而加速了变构抑制剂的结合（表现为更快的结合速率）。
4. 临床前功能验证（细胞与动物模型） * 细胞水平验证： * 信号抑制：在等基因的MCF10A细胞系（分别表达野生型、E542K、E545K、H1047R PIK3CA）中，RLY-2608选择性地抑制了突变细胞中PI3K下游标志物Akt的磷酸化，而Alpelisib对野生型和突变型细胞无差别抑制。 * 增殖抑制：在内源性PIK3CA突变癌细胞系（如T47D）和野生型癌细胞系（如SKBR3）中，RLY-2608选择性抑制突变细胞的增殖。 * 动物模型验证： * 肿瘤生长抑制：在携带PIK3CA突变（H1047R或E545K）的人乳腺癌细胞系异种移植模型或患者来源异种移植模型中，口服RLY-2608能显著抑制肿瘤生长，甚至导致肿瘤消退。其单药或与氟维司群（fulvestrant， 雌激素受体降解剂）、瑞博西尼（ribociclib， CDK4/6抑制剂）联用均显示出强效抗肿瘤活性。 * 安全性评估：与Alpelisib相比，即使在RLY-2608高剂量下，荷瘤小鼠的血清胰岛素和C肽水平（反映葡萄糖稳态紊乱的标志物）也仅轻微升高或接近基线水平，显著优于Alpelisib引起的剧烈升高。这表明RLY-2608成功地将抗肿瘤活性与高胰岛素血症副作用解耦。
5. 临床概念验证（初步人体试验） * 研究设计：数据来自正在进行的RLY-2608首次人体I/II期临床试验（REDISCOVER研究， NCT05216432）的剂量递增部分。 * 病例报告： * 病例1（激酶结构域突变）：一名携带PIK3CA H1047R突变的晚期HR+ HER2低表达乳腺癌患者，在接受多线治疗后接受RLY-2608单药治疗。8周后影像学评估达到部分缓解（靶病灶缩小36%），且未观察到与野生型PI3Kα抑制相关的高血糖或皮肤反应等不良事件。 * 病例2（螺旋结构域突变）：一名携带PIK3CA E542K突变的晚期HR+ HER2-乳腺癌患者，在接受氟维司群联合哌柏西利治疗后进展，接受RLY-2608联合氟维司群治疗。8周后达到部分缓解（一个软组织靶病灶完全消失），葡萄糖稳态未受影响。
研究的主要结果 1. 构象差异揭示变构网络：MD模拟和结构研究证实，H1047R突变破坏了p110α C末端尾巴的稳定埋藏状态，使其倾向于“解离”构象。这种扰动通过一个变构网络（涉及F954、HRD基序中的D915和激活环）传递，导致激活环区域的构象动态性增加，采样到一个更“活跃”的酶构象集合。这一发现为针对突变体特异性构象进行变构抑制提供了理论基础。 2. 成功发现首个变构突变选择性抑制剂苗头化合物：通过独特的DEL筛选策略，成功鉴定出化合物[1]，其结合动力学显示对H1047R突变体的结合速率比野生型快约10倍，初步在生化水平显示出约2倍的抑制选择性，且作用机制为非ATP竞争性，证实为变构抑制剂。 3. 明确变构结合位点与选择性机制：共晶结构显示，RLY-2608及其前体化合物结合于激酶结构域的一个隐秘变构口袋。该口袋的打开需要激活环（含F937）的位移，而这一位移受到上游C末端尾巴构象的调控。在野生型中，埋藏的尾巴限制了该口袋的可及性；在突变体中，解离的尾巴使口袋更易打开，从而解释了化合物对突变体的选择性结合（更快的on-rate）。序列比对也解释了其对其他PI3K亚型的选择性。 4. 全面的临床前验证：RLY-2608在细胞模型中显示出对多种热点突变（H1047R， E542K， E545K）的选择性抑制活性。在多种PIK3CA突变异种移植模型中，RLY-2608表现出与正构抑制剂Alpelisib相当甚至更优的抗肿瘤功效，同时显著减轻了对胰岛素水平的影响，证实了“解耦”效应。 5. 初步临床疗效与安全性证据：两个独立的病例报告提供了早期临床概念验证，表明RLY-2608单药或联合治疗能在PIK3CA激酶域和螺旋域突变的晚期乳腺癌患者中诱导客观肿瘤缓解，且未出现典型的高血糖等野生型PI3Kα抑制相关毒性。这初步支持了其突变选择性的临床转化。
研究的结论与意义 本研究成功开发并初步验证了RLY-2608，这是首个进入临床阶段、具有突变选择性的变构PI3Kα抑制剂。其核心价值在于： * 科学价值：研究整合了冷冻电镜、分子动力学模拟、DNA编码库筛选和结构生物学，成功地将对蛋白质构象动力学的理解转化为全新的药物发现策略，为解决激酶抑制剂领域长期面临的突变选择性和亚型选择性难题提供了一个范例。 * 应用价值：RLY-2608有望克服现有正构PI3Kα抑制剂的主要临床局限性。通过选择性抑制致癌突变体而保留野生型PI3Kα的功能，它可能提供更宽的治疗窗口，允许更高的靶点抑制强度，并减少高血糖等副作用的管理负担。这为PIK3CA突变癌症患者（尤其是乳腺癌）提供了潜力更优的单药及联合治疗（如与CDK4/6抑制剂、内分泌治疗的三联疗法）新选择。
研究的亮点 1. 创新性的多技术融合策略：将前沿的结构生物学（冷冻电镜）、计算模拟（长时程MD）与高通量筛选技术（DEL）深度融合，理性指导了针对“不可成药”靶点变构位点的药物发现。 2. 对构象动力学的深刻洞察与应用：不仅解析了静态结构，更通过MD模拟揭示了突变如何改变蛋白质的构象能量景观和动态网络，并巧妙地将这种动态差异作为实现选择性的“抓手”。 3. 精巧的DEL筛选设计：通过使用全长蛋白、封闭正构位点、以及基于突变/野生型差异富集进行筛选这三个关键设计，极大地提高了发现变构、突变选择性苗头化合物的成功率。 4. 完整的从实验室到临床的转化证据链：研究从基础机制探索（构象差异）到苗头化合物发现、优化、临床前体内外验证，再到早期临床概念验证，形成了一个完整、严谨的药物研发叙事，有力地支持了RLY-2608的潜力和其背后科学原理的可靠性。
其他有价值的内容 研究最后讨论了该平台策略的普适性意义。作者指出，亚型和突变选择性的问题是肿瘤靶向治疗中的常见挑战。本研究所展示的通过变构抑制（而非传统的正构抑制）来克服这一难题的方法，以及整合使用冷冻电镜、分子动力学和DEL筛选的技术路线，对未来针对其他重要但具有挑战性的肿瘤靶点具有重要的启发和借鉴意义。