关于乳腺癌空间转录组图谱揭示静脉生态位调控淋巴细胞外渗机制的研究报告
一、 研究团队与发表信息
本研究由王鑫、王展宇、廖启俊等来自多个研究机构的研究人员共同完成，主要合作单位包括国家癌症中心/中国医学科学院肿瘤医院、深圳华大生命科学研究院等。该研究于2025年3月19日在线发表于国际顶级学术期刊 《自然·通讯》（Nature Communications） ，论文标题为“空间解析的乳腺癌图谱揭示调控淋巴细胞外渗的静脉生态位细胞间机制”（Spatially resolved atlas of breast cancer uncovers intercellular machinery of venular niche governing lymphocyte extravasation），论文DOI为10.1038/s41467-025-58511-0。
二、 学术背景与研究目标
科学领域： 本研究属于肿瘤免疫微环境（Tumor Microenvironment, TME）与空间生物学（Spatial Biology）的交叉领域，聚焦于乳腺癌的血管异质性和免疫细胞浸润机制。
研究背景与动机： 乳腺癌是一种高度异质性的疾病，尽管靶向治疗和免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）已取得进展，但其疗效在多数患者中仍有限，部分原因在于肿瘤微环境中免疫浸润不足。淋巴细胞从血液循环进入肿瘤组织依赖于血管内皮细胞（Endothelial Cells, ECs），尤其是毛细血管后微静脉（Post-capillary Venules）是淋巴细胞外渗（Extravasation）的主要通道。然而，肿瘤血管系统具有显著的异质性和可塑性，传统单细胞测序技术丢失了关键的空间位置信息，而常规空间转录组技术分辨率不足以精确定位散布的内皮细胞和血管周围细胞。因此，肿瘤内不同功能亚型血管（如动脉、静脉、毛细血管）的空间分布、表型特征及其与免疫细胞的相互作用机制尚不清楚，特别是血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells, VSMCs）在此过程中的作用被严重忽视。
研究目标： 本研究旨在利用超高分辨率空间转录组技术，构建涵盖不同分子亚型的人类乳腺癌空间全景图谱，精细解析肿瘤血管系统（包括内皮细胞和平滑肌细胞）的异质性，并揭示其调控淋巴细胞浸润的细胞间协作机制，以期为改善乳腺癌免疫治疗提供新的见解和潜在靶点。
三、 详细研究流程与方法
本研究是一项综合性的多组学分析，结合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、超高分辨率空间转录组测序（Stereo-seq）以及组织病理学验证，具体流程如下：
1. 样本收集与处理： * 研究对象： 研究纳入了23名乳腺癌患者的30个新鲜冷冻组织样本，包括23个原发肿瘤和7个配对的转移淋巴结。样本覆盖了所有四种主要的乳腺癌分子亚型（Luminal A型、Luminal B型、HER2阳性型、三阴性型）。 * 样本处理： 所有样本均用于制备Stereo-seq空间转录组芯片。同时，从其中6名患者的肿瘤组织中分离细胞进行scRNA-seq，以构建细胞类型参考图谱。所有Stereo-seq切片的相邻组织切片用于苏木精-伊红（H&E）染色、免疫组织化学（IHC）和多重免疫荧光（mIF）验证。
2. 单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析： * 实验与数据分析： 对6个乳腺癌样本进行了scRNA-seq，获得了78，848个高质量细胞。基于经典标记基因，将这些细胞注释为13种主要细胞类型，包括肿瘤细胞、T/NK细胞、B细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞（ECs）、平滑肌细胞/周细胞（SMCs）等。 * 细胞亚群鉴定： 对内皮细胞和平滑肌细胞进行了亚聚类分析。内皮细胞被稳健地分为三个亚型：静脉内皮细胞（Venular ECs, VECs，标志物为ACKR1, PLVAP）、动脉内皮细胞（Arterial ECs, AECs，标志物为IGFBP3） 和毛细血管内皮细胞（Capillary ECs, CECs，标志物为PLVAP）。平滑肌细胞被分为三个亚群，其中SMC.1亚群高表达稳态趋化因子CCL21和CCL19，被鉴定为静脉平滑肌细胞（Venular SMCs, VSMCs）；SMC.2亚群表达骨骼肌标志物，被鉴定为动脉平滑肌细胞（Arterial SMCs, ASMCs）。这些亚型在外部scRNA-seq数据集中得到了验证。
3. 超高分辨率空间转录组测序（Stereo-seq）与图谱构建： * 核心技术： 本研究采用了创新的空间增强分辨率组学测序（Spatial Enhanced Resolution Omics-sequencing, Stereo-seq） 技术。该技术结合了220纳米DNA纳米球（DNB）图案化阵列和原位组织RNA捕获，能够实现细胞级分辨率的空间转录组图谱构建，克服了传统Visium等技术（基于55微米点阵）分辨率不足的局限。 * 数据生成： 对30个样本进行Stereo-seq，共产生超过49亿个DNB数据点。为了平衡分辨率和基因检出率，将原始数据卷积成两种伪点（Pseudo-spot）进行分析：Bin50点（50×50 DNB，直径约25微米，覆盖3-5个细胞） 用于高精度空间分析；Bin200点（200×200 DNB） 用于与常规空间转录组分辨率相当的分析。 * 细胞类型空间定位： 使用稳健细胞类型分解（Robust Cell Type Decomposition, RCTD） 算法，将scRNA-seq参考数据集的细胞类型组成信息反卷积到每个Bin50空间点上，从而在组织切片上绘制出各种细胞类型（包括上述血管亚型）的精确空间分布图。该空间注释与相邻切片的H&E染色和CD31（内皮标记）IHC染色结果高度一致。
4. 空间共定位与细胞通讯分析： * 空间邻近性量化： 为了研究不同细胞类型在空间上的相互关系，研究者定义了富集分数（Enrichment Score, ES） 和标准化富集分数（Normalized Enrichment Score, NES） 两种指标，分别在Bin50（单个点内）和Bin150（中心点及其八个邻域点）两种观测尺度上，计算特定细胞类型（如T/NK细胞）与目标血管亚型（VECs， AECs， CECs）的共定位强度。 * 细胞间通讯推断： 利用CellChat软件包对scRNA-seq数据进行分析，预测不同细胞类型对之间特异的配体-受体相互作用（Ligand-Receptor Interactions, LRIs）。然后，在Stereo-seq空间数据中验证这些预测的LRIs是否在相应的发送细胞和接收细胞共存的区域确实存在共表达，从而筛选出在空间上共定位的、功能上重要的相互作用对。
5. 临床队列分析与功能验证： * 生存分析： 利用从单细胞数据定义的静脉内皮细胞（VECs）和静脉平滑肌细胞（VSMCs）特征基因集，在大型公共乳腺癌队列（如METABRIC和TCGA）中估算患者肿瘤中这些静脉成分的比例，并分析其与患者总生存期（Overall Survival, OS）的关系。同时，进行了多变量回归分析以评估其独立的预后价值。 * 验证队列： 建立了一个包含296名患者的独立乳腺癌复发队列，通过定量IHC分析肿瘤内ACKR1+静脉的密度，验证静脉密度与临床复发风险的关系。 * 体外功能实验： 建立了内皮细胞-外周血单个核细胞（PBMC）共培养系统，通过过表达ACKR1，验证了ACKR1介导的CCL2或CCL5信号能显著增强PBMC在内皮单层下的迁移能力。
四、 主要研究结果
1. 构建了超高分辨率的人类乳腺癌空间转录组图谱： 研究成功绘制了涵盖四种分子亚型的30个乳腺癌样本（包括原发灶和转移淋巴结）的空间细胞景观图。图谱清晰地展示了肿瘤细胞、免疫细胞（T/NK、B细胞、巨噬细胞）和基质细胞（内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞）的详细分布，并揭示了转移淋巴结中肿瘤浸润性B细胞和T/NK细胞显著增加。
2. 揭示了肿瘤内皮细胞的异质性及其免疫调节功能： scRNA-seq和Stereo-seq分析共同证实，肿瘤内皮细胞存在显著的异质性。静脉内皮细胞（VECs）高表达ACKR1、PLVAP以及MHC II类分子（如HLA-DRB1）、趋化因子CCL14等基因，其功能富集于抗原呈递和免疫激活通路，提示其具有免疫调节特性。空间分析发现，毛细血管内皮细胞（CECs）主要分布在肿瘤内部，与肿瘤细胞空间关系紧密；而静脉内皮细胞（VECs）则显著富集于T/NK细胞和B细胞周围，并与三级淋巴结构（Tertiary Lymphoid Structures, TLSs）内的血管网络几乎完全重合。 在转移淋巴结中，静脉的比例显著高于原发肿瘤。
3. 鉴定了静脉平滑肌细胞（VSMCs）作为CCL21/CCL19的主要来源： 对平滑肌细胞的亚群分析发现，SMC.1亚群（即VSMCs）特异性高表达稳态趋化因子CCL21和CCL19。空间共定位分析显示，CCL21+的VSMCs与ACKR1+的VECs在空间上紧密共定位，且两者都富集在淋巴细胞聚集的区域。这一发现颠覆了传统上认为CCL21主要由静脉内皮细胞表达的认知，明确了静脉平滑肌细胞是肿瘤微环境中CCL21/CCL19趋化因子的主要细胞来源。
4. 证明了静脉成分与良好的临床预后和免疫浸润相关： * 预后价值： 在METABRIC和TCGA队列中，高比例的VECs或VSMCs特征与患者更长的总生存期显著相关。多变量分析表明，即使在调整了年龄、分期、淋巴结转移和受体状态后，VECs和VSMCs仍然是独立的预后保护因素。当两者同时纳入模型时，其保护作用消失，提示它们在功能上相互依赖。 * 免疫浸润： 相关性分析显示，VECs和VSMCs的比例与T/NK细胞、B细胞的浸润水平呈最强正相关。在独立验证队列中，ACKR1+静脉密度高的肿瘤患者复发风险显著更低。 * 静脉成分促进淋巴细胞聚集： 空间分析表明，VSMCs与T/NK细胞、B细胞、巨噬细胞显著共定位。在TLS区域外，距离TLS最近的血管也主要是静脉。
5. 阐明了静脉生态位协同促进淋巴细胞浸润的细胞间机制： * 基因模块分析： 对同时含有VECs和VSMCs的空间点进行差异表达分析，发现了194个差异基因。共表达分析鉴定出M3和M4两个基因模块，分别高表达于T/NK细胞和B/巨噬细胞，并富集于T细胞受体信号和抗原呈递通路。这两个免疫激活模块在VECs和VSMCs共存的区域表达最高，提示这两种细胞的共存是血管周围淋巴细胞有效激活的前提。 * 空间细胞通讯网络： 通过整合scRNA-seq和Stereo-seq数据，筛选出8对在空间上共定位的关键配体-受体相互作用对，构建了静脉生态位的通讯网络： * VSMCs → T/NK/B细胞：CCL21/CCL19 - CCR7。 这是淋巴细胞被招募至静脉的起始信号。 * VSMCs → VECs：CCL2 - ACKR1。 * T/NK细胞 → VECs：CCL5 - ACKR1。 * ACKR1的核心作用： ACKR1是一种非典型趋化因子受体，它不介导细胞内信号传导，而是通过内化和转运趋化因子（如CCL2、CCL5），在细胞间建立趋化因子梯度。体外实验证实，过表达ACKR1的内皮细胞单层能显著增强在CCL2或CCL5趋化下PBMC的跨内皮迁移。
基于以上结果，研究提出了一个协同作用模型（图7）： 循环中的CCR7+淋巴细胞首先被VSMCs分泌的CCL21/CCL19趋化至静脉。随后，VECs通过其表面的ACKR1受体，结合并转运来自VSMCs的CCL2和来自淋巴细胞的CCL5。这种ACKR1介导的趋化因子“仓库”作用，促进了VSMCs与淋巴细胞之间的近距离通讯，在血管壁处形成了一个趋化因子富集的静脉生态位（Venular Niche）。在这个生态位中，淋巴细胞被有效激活，进而跨过内皮屏障，迁移到血管外空间参与抗肿瘤免疫应答。
五、 研究结论与意义
结论： 本研究通过整合超高分辨率空间转录组学和单细胞转录组学，首次在人类乳腺癌中系统描绘了静脉生态位的精细结构和功能。研究鉴定出静脉平滑肌细胞（VSMCs）是CCL21/CCL19的主要生产者，并与静脉内皮细胞（VECs） 通过ACKR1介导的CCL2/CCL5信号协同作用，共同构建了一个促进淋巴细胞浸润的趋化因子富集微环境。高静脉密度与更强的肿瘤免疫浸润和更好的患者预后相关。
科学价值： 1. 提供了前所未有的高分辨率资源： 构建了迄今最全面的人类乳腺癌空间转录组图谱，为肿瘤微环境研究提供了宝贵的数据资源。 2. 深化了对肿瘤血管异质性的理解： 从空间和功能层面系统解析了不同血管亚型（动脉、静脉、毛细血管）及其周围平滑肌细胞的异质性，特别是明确了静脉成分的免疫调节特性。 3. 揭示了新的免疫调控机制： 首次将静脉平滑肌细胞置于肿瘤免疫浸润调控的核心位置，阐明了VECs和VSMCs通过多组趋化因子信号协同工作的新机制，更新了关于淋巴细胞外渗分子机制的传统认知。 4. 连接了基础发现与临床意义： 明确了静脉生态位作为预测免疫浸润和临床预后的生物标志物，为开发新的血管靶向疗法以增强免疫治疗效果提供了理论基础和潜在靶点（如ACKR1、CCL21/CCL19轴）。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究还观察到，与毛细血管倾向于分布在肿瘤内部不同，静脉更多位于原发和转移肿瘤的交界或外围，这可能限制了T/B细胞在肿瘤核心区的聚集，从而制约了静脉的免疫刺激功能。这提示未来研究探索能够诱导肿瘤内部静脉（特别是高内皮微静脉，HEVs）形成的疗法（例如联合抗VEGFR2、抗PD-L1和淋巴毒素-β受体激动剂），可能是一个有前景的增强免疫治疗疗效的方向。此外，研究暗示肿瘤可能通过扰乱CCL21+的成纤维网状细胞（FRCs）和剥夺HEVs的LTβR信号来重塑淋巴结中的静脉，这为理解肿瘤免疫逃逸提供了新视角。