一项发表于 Nature Communications 的研究系统描绘了组织驻留微生物群（tissue-resident microbiota，TRM）在正常结直肠黏膜、癌前息肉和结直肠癌（colorectal cancer，CRC）组织中的分布图谱。该研究由浙江大学医学院附属邵逸夫医院的 Haoyi Xiang、Baining Shen、Weifeng Lao、Bingjun Bai、Min Chen 等，联合海军军医大学长海医院、浙江中医药大学及杭州数微生物科技有限公司等多家单位合作完成，通讯作者为 Zhangfa Song、Hangjin Jiang、Yuhao Wang 和 Huan Chen。论文于 2026 年发表于 *Nature Communications*，题为 “The landscape of tissue-resident microbiota across normal, polyp, and colorectal cancer tissues”。

一、研究背景与目的

结直肠癌是全球第三大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第二大原因。除了遗传、表观遗传及间质微环境等传统因素外，肠道菌群已被证实能够通过代谢产物、免疫调节和直接上皮相互作用促进结直肠癌发生。然而，近年来越来越多的证据表明，直接定植于宿主组织内部的组织驻留微生物群（TRM）可能在肿瘤生物学中发挥更直接的作用。与肠腔菌群不同，TRM 与宿主细胞存在物理接触，可能在早期上皮转化中扮演关键角色。尽管如此，TRM 在正常黏膜、癌前息肉和结直肠癌组织中的分布规律和组成特征此前尚未被系统定义。

本研究旨在通过大规模多队列分析，明确 TRM 在不同结直肠组织类型间的分布和组成差异，并进一步评估其与肿瘤分期、临床结局及其他临床病理特征之间的关联，为未来机制研究提供基础框架。

二、研究流程与实验方法

该研究是一项横断面多队列研究，共纳入 1134 例临床标本，包括正常黏膜、腺瘤性息肉和浸润性癌组织。样本来源于浙江大学医学院附属邵逸夫医院生物样本库及另一独立临床中心。研究分为发现集（discovery set）和验证集（validation set）。发现集包含 818 例样本（正常 182 例、息肉 68 例、CRC 568 例），验证集包含 204 例样本（正常 45 例、息肉 17 例、CRC 142 例）。此外，研究还纳入了一个由 112 例样本组成的独立外部验证队列，来自另一家临床中心。

研究首先对组织样本进行严格的前处理，包括新鲜组织或冻存组织的清洗、表面剥离及中央核心取材（约 200 mg），以最大程度减少环境微生物污染。组织细菌载量通过靶向 16S rRNA 基因 V9 区域的定量 PCR 进行测定，并以大肠杆菌 DNA 构建标准曲线。细菌培养实验在哥伦比亚血琼脂平板上进行，以验证组织中存在活菌。

为获得高质量细菌 DNA，研究比较了两种 DNA 提取试剂盒，最终选用 QIAamp PowerFecal (Pro) DNA Kit，因其对组织样本的提取效率更高。样本处理过程中设置了环境阴性对照（以 PBS 替代组织）和无模板对照（DEPC 水），用于后续污染校正。

16S rRNA 基因扩增子文库构建采用了特殊优化的两步 PCR 策略。第一轮 PCR 使用 5’ 端生物素标记的引物扩增 V4 高变区，随后利用链霉亲和素磁珠富集生物素标记的 PCR 产物，再进行第二轮索引 PCR。该方法提高了低丰度细菌 DNA 的富集效率，增强了对组织内微生物检测的特异性。测序在 Illumina NovaSeq 平台上进行，采用 2 × 250 bp 双端测序。

生物信息学分析流程包括：使用 VSEARCH 和 USEARCH 对原始序列进行双端合并、质量过滤、去冗余、去噪（UNOISE3）和嵌合体去除；以 SILVA 数据库为参考进行分类学注释；过滤真核生物和线粒体来源的非特异性序列。样本经测序深度标准化（每个样本随机抽取 1000 条 reads）后进行下游分析。污染校正基于定量 PCR 数据与测序相对丰度的结合，计算每个物种的绝对量，并根据阴性对照样本中物种的中位绝对丰度进行扣除，同时采用二项检验筛选显著高于背景的类群。

微生物群落多样性分析采用 Bray-Curtis 距离的主坐标分析（PCoA）和去趋势对应分析（DCA），并使用 PERMANOVA 检验组间差异显著性。差异物种筛选采用 LEfSe（线性判别分析效应大小）和 Cochran-Armitage 趋势检验。为区分 TRM 与肠腔菌群，研究整合了来自七个公共数据集的 CRC 患者粪便宏基因组数据，并使用 MMuphin 软件包校正批次效应，采用 ANCOM-BC 进行差异丰度分析。

研究还构建了随机森林分类模型，用于区分正常、息肉和 CRC 组织状态。建模前采用累积和缩放（CSS）标准化处理微生物数据，随后通过五折交叉验证、特征重要性排序、低相关性和高流行率过滤等步骤筛选核心判别菌属。模型性能通过受试者工作特征曲线下面积（AUC）进行评估，并在独立外部验证队列中进行验证。此外，研究还采用荧光原位杂交（FISH）技术在组织原位验证了模型识别出的关键细菌的空间分布和丰度变化。

三、主要研究结果

研究首先比较了正常和 CRC 组织中的 TRM 组成。PCoA 和 DCA 分析显示，正常组织和 CRC 组织的细菌群落结构显著分离。定量 PCR 和培养实验证实 CRC 组织中的细菌载量显著高于正常和息肉组织，而正常和息肉之间无显著差异。LEfSe 分析发现，正常组织显著富集假单胞菌科（Pseudomonadaceae），而 CRC 组织富集具核梭杆菌属（*Fusobacterium*）、拟杆菌属（*Bacteroides*）和肠杆菌属（*Enterobacteroides*）等已知与 CRC 发展相关的类群。进一步比较 TRM 与粪便菌群显示，二者在群落结构、α 多样性和优势属组成上存在显著差异，差异丰度类群的相关性较弱（ρ = 0.106），表明 TRM 代表独立的微生物群落，无法通过粪便检测充分反映。

接下来，研究评估了 TRM 与 CRC 患者临床特征之间的关系。按照年龄、性别、分化程度、TNM 分期、肿瘤部位和生存状态分层后，PCoA 分析未观察到显著的群落分离。热图分析虽显示部分菌属在特定亚组中有相对富集趋势，但均未达到统计学显著水平。随机森林分类模型对上述临床特征的判别 AUC 在训练集中为 0.565–0.714，在验证集中为 0.541–0.762，均未超过 0.7。多因素 Cox 回归和 LASSO-Cox 模型进一步显示，单个微生物类群对生存结局的贡献接近零（风险比接近 1.0），且加入微生物数据并不能提高仅基于临床变量的生存预测性能。这些结果提示，TRM 组成在已确诊的 CRC 内部相对稳定，与临床异质性无强关联。

研究随后将息肉样本纳入分析，比较正常、息肉和 CRC 三种组织状态下的 TRM 组成。PCoA 和 DCA 分析揭示三种组织类型对应三个不同的微生物生态结构。在科水平，梭杆菌科（Fusobacteriaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、纤毛菌科（Leptotrichiaceae）和伯克霍尔德菌科（Burkholderiaceae）在正常组织中丰度最低，在息肉组织中居中，在 CRC 组织中最高；而红蝽菌科（Coriobacteriaceae）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）和坦纳菌科（Tannerellaceae）在正常组织中最为丰富。在属水平，梭杆菌属、链球菌属、消化链球菌属、纤毛菌属、马西利亚菌属和普雷沃氏菌属表现出从正常到息肉再到 CRC 的递增趋势；而考拉杆菌属、柯林斯菌属、双歧杆菌属、假单胞菌属和阿克曼菌属则呈递减趋势（Cochran-Armitage 趋势检验，q 值 < 0.05）。值得注意的是，拟杆菌属、卟啉单胞菌属和弯曲杆菌属在 CRC 组织中的丰度显著高于正常和息肉组织。

基于上述差异，研究构建了配对分类模型以区分不同组织状态。通过特征选择和交叉验证，研究确定了四个核心菌属（假单胞菌属、Pigmentiphaga、细小单胞菌属和梭杆菌属）足以稳健区分息肉与 I 期 CRC（AUC 训练 0.986，验证 0.996）；六个菌属（假单胞菌属、副拟杆菌属、拟杆菌属、Pigmentiphaga、梭杆菌属和柯林斯菌属）可有效区分正常黏膜和息肉（AUC 训练 0.911，验证 0.954）。在独立外部验证队列中，正常 vs. 息肉、息肉 vs. CRC 和正常 vs. CRC 的 AUC 分别为 0.779、0.796 和 0.767。交叉验证和留一患者验证（LOPO）均支持模型的稳健性。此外，按肿瘤位置和微卫星不稳定状态分层分析显示，差异类群和模型性能在不同亚组间基本一致，表明 TRM 特征在很大程度上独立于常见临床变量。

FISH 实验结果与测序数据高度一致。荧光定量显示，假单胞菌属在正常组织中丰度最高，在息肉和 CRC 中逐渐降低；Pigmentiphaga 在息肉中最低；梭杆菌属则从正常到息肉再到 CRC 逐步增加，在 CRC 中达到最高水平。模型特异性菌属如副拟杆菌属、柯林斯菌属和拟杆菌属在正常组织中显著富集，细小单胞菌属仅在 CRC 中高度富集。

四、研究结论与意义

本研究系统揭示了 TRM 在正常黏膜、癌前息肉和 CRC 组织中的组成差异，明确了与结直肠肿瘤发生相关的微生物变化模式：促肿瘤菌群逐步增加，潜在保护性共生菌逐步减少。同时，研究证实 TRM 组成在已确诊 CRC 的不同临床分期和亚组之间保持相对稳定，与生存结局无显著关联。这表明 TRM 的改变可能主要发生在恶性转化的早期阶段，而非肿瘤进展的晚期事件。

研究的科学价值在于为理解 TRM 在结直肠癌发生中的潜在生物学作用提供了大规模、多层次的描述性基础。其应用价值体现在：虽然 TRM 检测需要组织标本，无法作为无创筛查工具，但在已有的息肉切除或活检标本中，TRM 分析可作为组织病理学评估的补充，为 CRC 生物学风险评估提供额外信息。未来研究可进一步探索将组织 TRM 特征转化为粪便或血液中的可检测信号，或将其与临床病理特征整合构建复合模型，以提高筛查和风险分层的临床应用价值。

五、研究亮点与局限性

本研究的主要亮点包括：样本规模大（1134 例），涵盖多种组织类型；采用优化的生物素标记两步 PCR 和链霉亲和素富集方法，显著提高了组织内低丰度细菌的检测灵敏度；通过严格的污染控制和绝对定量校正，增强了数据可靠性；利用机器学习模型筛选出可跨队列复现的核心微生物特征；并通过 FISH 技术实现了单微生物水平的原位验证。

研究也存在局限性：横断面设计无法推断因果关系；息肉样本数量相对较少；仍需要更多不同人群和测序平台的进一步验证；功能层面的机制研究尚缺乏。未来整合宏基因组、宏转录组和代谢组等多组学分析，将有助于深入阐明 TRM 影响早期结直肠肿瘤发生的分子机制。