本研究由上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室的童圣坤、覃宇禧、孙雅倩、高耀杰、宋沐沂、方涛及童垚俊等人完成，发表于 *Nature Biotechnology*（2026年在线发表）。研究团队针对细菌中基于Cas13的RNA调控工具存在的细胞毒性与旁切（collateral cleavage）问题，开发了一套可编程、多重且正交的基因控制系统，命名为SONAR（synthetic orthogonal nucleic acid activation and repression）。
细菌中大多数基因以操纵子（operon）形式组织，传统的基于DNA靶向的CRISPR干扰/激活（CRISPRi/a）工具在靶向操纵子内部基因时常产生极性效应（polar effects），难以实现单基因水平的精确调控。基于Cas13的RNA靶向系统理论上可实现转录后水平的精准调控，但野生型Cas13d在细菌中表达时会引起严重的生长抑制和旁观者基因（bystander gene）的非特异性敲低，这主要源于其被激活后对单链RNA的旁切活性。已有高保真度变体如hfCas13d和hpCas13d在真核系统中表现出降低的旁切效应，但在原核系统中的表现并不一致，且其保真度与整体核酸酶活性之间的关系尚不清晰。因此，本研究的目标是通过理性蛋白质工程改造Cas13d，获得在细菌中兼具高特异性与可调活性的变体，并在此基础上实现翻译抑制、多顺反子mRNA降解和翻译激活等多种调控功能的灵活切换。
研究流程可分为以下几个主要步骤。第一步，团队构建了双荧光报告系统，分别用组成型启动子独立转录sfgfp和mCherry，以同时定量靶基因敲低效率和旁观者基因敲低水平。通过在*E. coli*中系统比较野生型Cas13d、hfCas13d、hpCas13d以及嵌合变体hfhpcas13d，团队发现野生型Cas13d引起最强的生长抑制和旁观者敲低，hfCas13d显著缓解了这些效应，而hpCas13d与野生型表现相似。进一步通过改变核糖体结合位点（RBS）强度或融合ssrA降解标签来调节Cas13d蛋白表达水平，团队发现即使野生型Cas13d在低表达水平下也能实现较高特异性，而高保真度变体在高表达条件下同样会丧失特异性并产生旁观者效应。这表明Cas13d的表观特异性很大程度上由其有效活性水平决定，而非仅由特定突变决定。
第二步，团队采用基于柔性区域截短的理性蛋白质工程策略，利用AlphaFold 3预测的RfxCas13d结构，识别出靠近HEPN催化中心的三个柔性区域（残基246–255、849–850和877–882），对其进行了系统性截短，构建了18个截短变体。通过双荧光报告系统筛选，这些变体展现出从近本底到野生型水平的梯度式RNA切割活性。其中，Cas13d Δ251–255表现出优越的特异性和中等活性，而Δ250–255保持了较强的RNase功能。分子动力学模拟（300 ns）显示，柔性区域截短通过重塑催化中心构象和调节整体结构动力学来影响RNase活性，解释了截短长度与酶活性之间的非线性关系。此外，同样的截短策略应用于LwaCas13a也获得了活性梯度分布，证明该方法在Cas13家族中具有通用性。
第三步，团队研究了如何解耦Cas13d的RNase活性与RNA结合功能。通过在crRNA间隔序列的5′端引入不同数量的邻近错配（proximal mismatches），逐步减弱RNase切割活性而保留RNA结合能力。在mCherry–sfgfp多顺反子报告系统中，完全匹配的crRNA引导atnCas13d高效降解整个多顺反子转录本，而含有5至8个错配的crRNA（如pm7crRNA）则主要抑制sfgfp的翻译而对上游mCherry影响很小。RT–qPCR证实了这种功能切换：无错配或两个错配导致mCherry和sfgfp转录本均被降解，而五个或八个错配仅抑制sfgfp翻译且保留了其mRNA稳定性。为验证该策略的序列通用性，团队构建了16个具有不同GC含量和序列背景的靶标文库，发现pm7crRNA在大多数靶标上均能实现有效的翻译抑制和可忽略的转录本降解，仅在高GC含量或高度结构化序列中效率有所下降。
第四步，团队构建了多功能效应蛋白atnCas13d–IF3。系统筛选多种翻译激活结构域后，发现细菌翻译起始因子IF3融合到dcas13d上可实现最高达3.5倍的报告基因激活，且背景和毒性最低。机制研究表明，dcas13d–crRNA复合物可保护mRNA免受RNase E降解，而IF3通过招募30S核糖体亚基协同增强mRNA稳定性和翻译效率。将IF3融合到atnCas13d后，该效应蛋白在pm7crRNA引导下可实现翻译激活，在完全匹配crRNA引导下实现转录本降解，在错配crRNA引导下实现翻译抑制。在多顺反子调控中，靶向5′非翻译区（UTR）可激活整个操纵子，靶向翻译起始区可实现基因特异性抑制，而靶向3′UTR可因保护mRNA免受3′–5′外切酶降解而产生中等程度的激活。正交性实验表明，在中低丰度报告基因条件下，atnCas13d–IF3可同时实现一个基因的翻译抑制、另一个基因的翻译激活以及第三个基因的转录本降解，且相互干扰较小；但在高丰度转录本条件下，转录本降解引入的调控串扰（crosstalk）会削弱翻译激活效果。
第五步，团队将atnCas13d–IF3应用于*E. coli*番茄红素（lycopene）生物合成途径的优化。通过靶向31个候选内源基因和质粒上的合成途径基因，高通量筛选发现调节ptsHIcrr、crtEBI、dxs、ldhA、ispB和ispU等关键节点可显著提高番茄红素产量。特别是对必需基因ispU和ispB的可调非致死敲低，分别使比产量达到2.43和1.63 mg/g细胞干重，这是传统DNA编辑方法难以实现的。组合调控中，同时抑制ispU并激活crtEBI使比产量达到2.63 mg/g，三重干预（ispU1–crtEBI1–ispB1）在摇瓶补料发酵中达到12.9 mg/L番茄红素，在3 L发酵罐中达到32.3 mg/L，较亲本菌株（13.54 mg/L）提高了2.39倍。
本研究的主要结论是，Cas13d的表观保真度由其有效活性水平决定，通过柔性区域截短可获得具有梯度活性的减毒变体；5′端邻近错配可实现RNase和RNA结合功能的解耦，从而使单一效应蛋白在crRNA设计指导下在翻译抑制和转录本降解之间灵活切换；融合IF3进一步赋予翻译激活能力，构建的SONAR系统能够在多顺反子mRNA内部实现基因特异性的激活、抑制和降解的正交调控。该研究的科学价值在于揭示了Cas13效应蛋白活性与特异性之间的内在关系，提出了通用的蛋白质工程策略来调节Cas13家族活性。其应用价值在于为细菌代谢工程和合成生物学提供了一个可编程、可扩展的多功能RNA调控平台，特别适用于对必需基因进行精细调节和多基因途径的组合优化。该研究的亮点包括：柔性区域截短策略的通用性、基于crRNA错配的功能切换机制、以及将翻译激活与RNA切割功能整合到单一效应蛋白中的模块化设计。