本研究由泰国朱拉隆功大学（Chulalongkorn University）石油与石化学院的导电与电活性聚合物研究单元（The conductive and electroactive polymer research unit, the petroleum and petrochemical college）、泰国蒙固国王科技大学吞武里分校（King Mongkut’s university of technology thonburi）科学学院化学系，以及泰国红十字会朱拉隆功国王纪念医院新发传染病健康科学中心（Thai red cross emerging infectious disease health science centre, king chulalongkorn memorial hospital, the thai red cross society）的研究人员共同合作完成。该研究于2025年6月21日在线发表于《Journal of Electroanalytical Chemistry》期刊（第992卷，论文编号119281）。

本研究隶属于生物传感器与电化学分析交叉领域，主要聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）的早期诊断。阿尔茨海默病是一种主要的神经退行性痴呆，其病理特征为大脑中β-淀粉样蛋白斑块和磷酸化tau蛋白缠结的积累。目前，临床诊断依赖于脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）或正电子发射断层扫描（positron emission tomography, PET），但这些方法成本高昂、操作复杂且需要专业实验室环境。因此，开发快速、简便、低成本的诊断工具具有迫切需求。在众多生物标志物中，苏氨酸217位点磷酸化的tau蛋白（phosphorylated tau protein at threonine 217, p-tau 217）展现出比总tau蛋白和其他磷酸化亚型（如p-tau 181, p-tau 231）更高的特异性，与淀粉样蛋白病理密切相关，并且能在临床症状出现前20-30年指示疾病，被认为是用于早期和临床前检测的可靠生物标志物。当前p-tau 217的主流检测技术是电化学发光（electrochemiluminescence, ECL），但其存在成本高、复杂性高等问题，不利于便携式诊断设备的开发。相比之下，电化学免疫传感器具有简单、快速、成本低和易于便携化等优势。本研究旨在开发一种基于酸性处理多壁碳纳米管（acid-treated multiwalled carbon nanotubes, MWCNT-COOH）和掺杂聚(3,4-乙烯二氧噻吩)（doped poly(3,4- ethylenedioxythiophene), dPEDOT）的新型无标记电化学免疫传感器（label-free electrochemical immunosensor, LBEI），用于高灵敏度、高选择性检测p-tau 217。研究目标包括验证该传感器的分析性能（灵敏度、线性范围、检出限），评估其选择性、稳定性、重现性，并最终在真实人脑脊液样本中验证其临床应用的可行性。

本研究的详细工作流程包含以下几个关键步骤： 第一步：核心材料的合成与制备。 研究人员首先通过化学氧化聚合法合成了PEDOT，随后使用对甲苯磺酸（para-toluenesulfonic acid, p-TSA）对其进行掺杂，得到dPEDOT，最终产物为深蓝色粉末。同时，通过使用浓硝酸和浓硫酸的混合酸对原始多壁碳纳米管进行氧化处理，在其表面引入羧基（-COOH），制备了MWCNT-COOH。最后，将MWCNT-COOH在乙二醇和二甲亚砜的混合溶剂中超声分散，再加入dPEDOT粉末，持续搅拌三天，制备了MWCNT-COOH/dPEDOT复合物分散液。 第二步：免疫传感器的构建与修饰。 研究使用丝网印刷碳电极（screen-printed carbon electrodes, SPCE）作为传感平台。首先，将4.5 μL的MWCNT-COOH/dPEDOT分散液滴涂在SPCE的工作电极表面，70°C干燥2小时，形成导电增强层。随后，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）化学交联法激活抗体：将p-tau 217抗体在EDC/NHS的磷酸盐缓冲液（PBS）混合液中孵育2小时，形成活化的抗体复合物（Ab/EDC/NHS）。然后，将5 μL该复合物滴涂到已修饰的电极上，室温孵育1.5小时，使抗体通过酰胺键共价固定在MWCNT-COOH/dPEDOT层表面。之后，用PBS冲洗未固定的抗体。为了减少非特异性吸附，用牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）溶液封闭电极表面未反应的活性位点，孵育1小时后清洗。最终得到的修饰电极为MWCNT-COOH/dPEDOT/Ab/EDC-NHS/BSA结构，于4°C真空密封保存备用。 第三步：材料与传感器的表征。 研究人员采用多种技术对合成材料和每一步修饰后的电极进行了系统表征。使用场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）观察了PEDOT、dPEDOT的形貌以及电极表面各修饰层（导电层、抗体层、BSA层、抗原结合层）的微观结构变化，确认了生物分子的成功固定。利用衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析了各修饰层的特征官能团，证实了dPEDOT中磺酸基团的存在、EDC/NHS介导的酰胺键形成以及抗体的成功固定。通过X射线光电子能谱（XPS）分析了MWCNT、MWCNT-COOH、PEDOT和dPEDOT的元素组成，结果显示酸处理后MWCNT的氧含量增加，证实了羧基化；dPEDOT的硫含量高于PEDOT，证实了对甲苯磺酸的成功掺杂。 第四步：电化学性能表征与优化。 使用循环伏安法（Cyclic Voltammetry, CV）、差分脉冲伏安法（Differential Pulse Voltammetry, DPV）和电化学阻抗谱（Electrochemical Impedance Spectroscopy, EIS）在含有铁氰化钾/亚铁氰化钾（[Fe(CN)6]3−/4−）的电解液中对电极的修饰过程进行监测。CV和DPV结果显示，MWCNT-COOH/dPEDOT修饰层显著增强了电极的电流响应并降低了峰电位差，表明其优异的导电性和促进电子转移的能力。在固定抗体（Ab/EDC-NHS）和抗原（p-tau 217）后，电流响应下降，这是由于蛋白质绝缘层阻碍了电子传递；而BSA封闭后电流响应有所回升，可能与BSA和PEDOT之间的静电相互作用有关。EIS的奈奎斯特图进一步支持了这一结论，MWCNT-COOH/dPEDOT和BSA层表现出较低的电荷转移电阻（Rct），而抗体和抗原的固定则增加了Rct。通过CV在不同扫描速率下的测试，利用Randles–Ševčík方程计算了电极的电化学活性表面积，发现MWCNT-COOH/dPEDOT修饰将SPCE的有效表面积从0.6674 cm²提高到了1.3554 cm²，增加了约一倍。此外，研究系统地优化了免疫传感器的关键参数，包括抗体浓度（20-50 μg/mL）、抗体固定时间（30-120分钟）、抗原孵育温度（4-37°C）和抗原孵育时间（30-90分钟）。通过DPV测量电流变化（ΔI）确定了最佳条件：抗体浓度30 μg/mL，抗体固定时间90分钟，抗原孵育温度25°C，抗原孵育时间90分钟。 第五步：分析性能评估。 在优化条件下，使用DPV技术对不同浓度的合成p-tau 217（0.1 至 105 pg/mL）进行检测。所有实验均独立重复三次（n=3），结果以平均值±标准误表示。DPV阳极峰电流随p-tau 217浓度增加而降低，这是由于抗原-抗体复合物的形成增加了电极表面的绝缘性。校准曲线在0.1-105 pg/mL范围内呈现出三个明显的区段：在0.1-1 pg/mL的低浓度区（区段I），电流变化平缓；在1-102 pg/mL的中浓度区（区段II），电流与浓度的对数呈良好的线性负相关（ipa = −0.0162x + 2.8026, R² = 0.9879），这是传感器最灵敏的检测范围；在102-105 pg/mL的高浓度区（区段III），由于电极表面可用结合位点趋于饱和，电流变化再次趋于平缓。基于区段I，该免疫传感器的表观测出限（LOD）为0.1 pg/mL，计算LOD为0.69 pg/mL。统计显著性分析（单因素ANOVA与Tukey多重比较检验）表明，各浓度点与空白组之间均存在显著差异（p < 0.05）。为了验证传感器的准确性，研究还使用了另一个商业来源（Mesoscale Discovery）的合成p-tau 217进行校准，所得校准曲线与主要来源（GeneMedi）的曲线斜率高度一致，且统计检验（独立t检验）显示在1-100 pg/mL范围内各浓度点均无显著差异（p > 0.05），证明了检测结果不受抗原来源影响。 第六步：选择性、稳定性、重现性及实际样本分析。 选择性测试表明，传感器对葡萄糖、尿酸、乳酸、抗坏血酸、氯化钾以及癌胚抗原（CEA）等潜在干扰物质均无明显响应（电流变化%），且这些干扰物与p-tau 217共存时，检测信号与p-tau 217单独存在时几乎相同，证明了传感器的高特异性。稳定性测试显示，将制备好的传感器在4°C真空密封储存长达四周，每周检测一次100 pg/mL的p-tau 217，其电流响应在前两周内保持高度稳定（偏差小于1%）。重现性测试中，七个独立制备的传感器对同一浓度p-tau 217的DPV响应相对标准偏差（%RSD）约为0.87%，表明制备工艺具有良好的重现性。最后，为评估临床适用性，研究使用该传感器对真实人脑脊液样本进行了检测，样本包括5份健康人和5份阿尔茨海默病患者的CSF。所有CSF样本中p-tau 217的检测信号均落在传感器最灵敏的线性区段（区段II）内，成功区分了不同来源的样本，初步证明了该传感器在复杂生物基质中检测p-tau 217的可行性和临床应用潜力。

本研究的主要结果清晰地展示了从材料合成到实际应用验证的全链条证据链。SEM、FTIR、XPS的表征结果共同证实了MWCNT-COOH和dPEDOT的成功制备及其在电极表面的有效复合，为传感器的高性能奠定了材料基础。电化学表征结果（CV、DPV、EIS）不仅实时监测并证实了每一步生物修饰的成功，更重要的是定量证明了MWCNT-COOH/dPEDOT复合材料能大幅提升电极的导电性和有效表面积，这是实现高灵敏度检测的关键。优化实验确定了传感器工作的最佳条件，确保了检测效率最大化。分析性能评估获得了宽达五个数量级的线性范围和低至0.1 pg/mL的检出限，这为检测早期阿尔茨海默病患者体内极低浓度的p-tau 217提供了可能。选择性、稳定性、重现性等性能测试结果，排除了传感器在实际应用中可能遇到的主要干扰和可靠性问题，为其走出实验室奠定了基础。最终，在真实人CSF样本中的成功检测，直接将实验室性能与临床需求对接，完成了从原理验证到应用演示的关键一跃。所有这些结果逻辑连贯，层层递进，共同支撑了研究的最终结论。

本研究得出结论：成功开发了一种基于MWCNT-COOH/dPEDOT复合材料的无标记电化学免疫传感器，用于高灵敏度检测阿尔茨海默病生物标志物p-tau 217。该传感器具有优异的分析性能（宽线性范围：0.1–105 pg/mL，低检出限：0.1 pg/mL）、高选择性、良好稳定性和重现性。其科学价值在于首次报道了利用DPV技术检测p-tau 217的无标记电化学免疫传感器，并深入阐述了MWCNT-COOH与dPEDOT的协同增效机制（提高表面积、增强导电性、提供固定位点）。其应用价值则体现在：1）为阿尔茨海默病的早期诊断提供了一种潜在的新型工具；2）相较于现有ECL等方法，该传感器架构更简单、成本更低，更有利于开发为便携式床旁诊断（point-of-care, POC）设备；3）成功在真实临床样本（CSF）中验证了其检测能力，向实际临床应用迈出了重要一步。

本研究的亮点在于：1. 方法新颖性：这是首篇报道使用差分脉冲伏安法（DPV）检测p-tau 217的无标记电化学免疫传感器的研究，填补了该技术在该特定生物标志物检测领域的空白。2. 材料创新与协同效应：创新性地将羧基化多壁碳纳米管（MWCNT-COOH）与对甲苯磺酸掺杂的PEDOT（dPEDOT）复合，充分发挥了MWCNT增加比表面积和导电性、dPEDOT提供优异本征导电性和磺酸基团、羧基提供共价固定位点的三重优势，实现了传感器性能的显著提升。3. 系统且严谨的验证：研究不仅进行了标准的分析性能测试，还特别使用了两种不同商业来源的合成抗原进行交叉验证，确保了检测结果的准确性和可靠性。4. 明确的临床转化导向：研究最终目标明确指向临床应用，不仅优化了传感器本身性能以满足检测需求，还完成了在真实人脑脊液样本中的验证，证明了其解决实际临床问题的潜力。

此外，研究中对传感器构建过程的详细表征（SEM, FTIR, XPS）、对电化学行为的深入分析（包括电化学活性表面积计算）、以及对各影响参数的全面优化，都体现了工作的系统性和深度，为后续研究者提供了可重复的模板和深入理解的依据。文中还将本传感器的性能与已报道的其他阿尔茨海默病传感器（基于不同检测方法和不同生物标志物）进行了对比，凸显了本工作在检测p-tau 217这一新兴标志物方面的独特优势和竞争力。