本文由Jiayu Hu、Zhihua Chen、Jingjing Li、Lulu Zhang、Jincheng Zhu、Chengyu Wang、Lei Cui和Kewen Zheng等人共同完成，研究团队来自上海大学环境与化学工程学院和理学院。该研究于2024年3月1日发表在《Tetrahedron》期刊上，论文标题为“A novel low-cytotoxicity fluorescent probe applied to monitor pH in vivo and in vitro”。
pH值是环境中的一个关键参数，在细胞过程和生产中具有不可替代的作用。细胞内pH值的异常变化可能导致多种疾病，如癌症、中风和阿尔茨海默病等。因此，监测细胞内pH值的变化对于探索细胞代谢、研究细胞功能以及更好地理解生理和病理过程至关重要。目前，许多pH检测方法已被提出，如酸碱指示剂滴定法、pH试纸和电化学方法等。然而，荧光成像技术因其高灵敏度、高选择性、优异的时空分辨率、快速响应时间和操作简便等优点，吸引了越来越多的关注。尽管如此，许多荧光探针的检测范围集中在强酸或强碱条件下，而人体内外环境通常不会处于这种极端条件。因此，开发一种能够检测弱酸到弱碱范围的荧光探针成为一项紧迫的任务。
本研究设计并合成了一种新型低细胞毒性荧光探针，命名为NAP-MP。该探针以1,8-萘二甲酰亚胺（1,8-naphthalimide）为荧光发射体，1-甲基哌嗪（1-methylpiperazine）为pH敏感基团，并利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane）提高其生物相容性。探针的荧光通过1-甲基哌嗪的质子化抑制光诱导电子转移（photoinduced electron transfer, PET）过程，从而增强荧光强度。密度泛函理论（density functional theory, DFT）计算也验证了荧光机制。
研究流程包括以下几个步骤： 1. 探针设计与合成：通过两步反应合成了NAP-MP探针，并利用核磁共振（NMR）和高分辨率质谱（HRMS）对其结构进行了表征。 2. 光谱特性研究：通过紫外-可见光谱和荧光光谱分析了探针在不同pH条件下的光谱特性。结果表明，探针在pH=6.0到pH=8.0范围内，荧光强度与pH值呈现良好的线性关系。 3. pH传感机制研究：通过核磁共振谱和DFT计算，验证了探针的pH传感机制。结果表明，1-甲基哌嗪的质子化抑制了PET过程，从而增强了荧光强度。 4. 可逆性测试：通过连续改变酸碱性条件，测试了探针的荧光强度变化。结果表明，探针在至少6次循环后仍保持较好的pH响应可逆性。 5. 选择性和光稳定性测试：测试了探针对常见离子和生物硫醇的选择性，结果表明探针仅对pH变化敏感。同时，探针在不同pH条件下表现出优异的光稳定性。 6. 应用研究：利用探针制备的水凝胶检测了环境中不同浓度的氨气。结果表明，水凝胶的荧光强度与氨气浓度呈现一定的线性关系。此外，探针成功用于活体HeLa细胞的pH变化成像。
本研究成功设计并合成了一种新型低细胞毒性荧光探针NAP-MP。该探针在pH=6.0到pH=8.0范围内表现出良好的线性灵敏度，具有高选择性、优异的光稳定性、可逆性和低细胞毒性。利用该探针制备的水凝胶在环境氨气检测中表现出色，同时探针成功用于活体HeLa细胞的pH变化成像。这些结果表明，NAP-MP探针在体外和体内pH检测应用中具有巨大的潜力。
本研究还详细介绍了探针的合成路线、光谱测量方法、DFT计算流程以及细胞毒性实验和荧光成像实验的具体操作步骤，为相关领域的研究人员提供了宝贵的技术参考。