本文属于类型a，即单一原创研究报告。以下是根据文档内容撰写的学术报告。

研究作者与发表信息

本研究由来自澳大利亚多个研究机构的科学家合作完成。通讯作者为Richard Mills和James Hudson，其联系邮箱分别隶属于默多克儿童研究所（Murdoch Children’s Research Institute, MCRI）和QIMR Berghofer医学研究所。研究成果发表于 nature cardiovascular research，文章于2025年6月25日在线发表，刊载于该期刊第4卷，页码为821–840。

研究背景

人类多能干细胞（human pluripotent stem, hPS）来源的心肌细胞在疾病建模和药物发现中具有重要应用前景，但其成熟度不足是长期制约该领域发展的核心瓶颈。已有研究表明，即便将hPS细胞来源的心肌细胞培养长达一年，其成熟程度仍无法达到体内同时间点的发育水平。这说明培养环境中可能缺乏驱动成熟的关键刺激，或存在抑制成熟的因素。心肌细胞成熟涉及多个维度的改变，包括肌节蛋白亚型转换、代谢从糖酵解向脂肪酸氧化转变、电生理特性成熟以及收缩功能的增强。此前的研究已发现多细胞混合、机械负荷、激素刺激、代谢转换和电刺激能够不同程度地促进成熟，但机制理解仍然有限。本研究的核心目标是利用人类心脏发育和成熟的转录组特征，筛选能够驱动hPS细胞来源心脏类器官（human cardiac organoids, hCOs）成熟的条件，并建立一种可重复的定向成熟方案。

研究流程与实验设计

研究的第一阶段是对比现有血清游离hCO方案（serum-free hCO, SF-hCO）与其他已发表的hPS细胞来源心肌细胞培养方案。研究者使用肌节蛋白亚型比例作为成熟度的量化指标，具体包括MYL2/MYL7和TNNI3/TNNI1的比例。结果显示，SF-hCO中TNNI3的最高比例仅为18%，相当于约20周胎龄心脏的水平，表明其仍处于妊娠中期阶段。因此，研究者选择心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I, cTnI）染色作为成熟度筛选的主要读数，并从人类心脏成熟转录组数据中识别出氧化代谢和干扰素信号通路作为潜在干预靶点。

第二阶段为小分子筛选。研究者测试了多种能够增强代谢和干扰素信号的化合物，包括孕酮（progesterone）、ERRβ/γ激动剂DY131、AMPK激活剂MK8722以及IFNλ1。筛选实验在96孔Heart-Dyno平台上进行，该平台能够使心脏细胞自组织形成微型化、受机械负荷的hCOs。单药筛选后，研究者进行组合筛选，发现MK8722与DY131或IFNλ1联合使用能够显著增加cTnI表达。然而，进一步的组合（如再加入孕酮或IFNλ1）并未带来额外的cTnI增加。基于这些结果，研究者确定了定向成熟方案（directed maturation protocol，DM-hCO）：在hCO形成的前两天加入2 μM CHIR99021，并在第24至28天短暂加入3 μM DY131和10 μM MK8722，共4天。刺激撤除后至少2天再进行功能评估，以确保评估的是成熟状态的持续效应而非急性药物效应。

第三阶段为机制验证与组学表征。研究者比较了急性DM处理与电刺激（120 bpm，5分钟）的磷酸化蛋白组学，发现两者共享1,024个差异调节磷酸位点，占48.2%。这些共享位点包括HDAC2 S394、GJA1（Cx43）S365、PLN S16/T17和MYL2 S15等心脏功能相关蛋白。KEGG通路分析显示DM处理和电刺激激活了相似的AMPK信号网络，并抑制甲羟戊酸/胆固醇生物合成通路。全局蛋白组学进一步显示DM-hCO中代谢蛋白显著上调，而未成熟特征如胰岛素信号和甲羟戊酸通路受到抑制。

第四阶段为细胞组成与单核转录组分析。单核RNA测序（snRNA-seq）将SF-hCO和DM-hCO与人类心脏组织数据（GSE156707）共聚类，发现hCO包含心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和心外膜细胞等多种细胞类型。通过TCF21谱系追踪实验，研究者证实hCO中的成纤维细胞具有心外膜来源。进一步分析显示，DM-hCO中TNNI3/TNNI1比例在三个心肌细胞亚群中分别从0.34、0.25和0.23增加到0.44、0.37和0.34。差异表达基因富集分析显示肌节成熟和氧化磷酸化通路上调。

第五阶段为功能成熟度评估。DM-hCO的自发收缩频率显著降低，收缩力增加，且50%松弛时间（TR50）未受不良影响。通过阻断If电流（1 μM cilobradine），研究者发现DM-hCO较SF-hCO更能维持节律稳定性。停搏后增强（post-rest-potentiation）实验显示DM-hCO的肌浆网功能增强，收缩力增加36%，接近人类心脏的43%。三维透射电子显微镜证实DM-hCO中存在广泛的肌浆网网络。Ryanodine阻断实验和CASQ2敲除实验进一步确认了肌浆网在频率调控中的关键作用。

第六阶段为药物反应验证。研究者使用12种CiPA化合物和17种临床相关心血管活性药物对DM-hCO进行药理学基准测试。所有高风险CiPA化合物在接近Cmax浓度时均使TR50增加32–64%，而低风险化合物即使在超生理浓度下也未引起TR50延长。心肌肌球蛋白激活剂danicamtiv与omecamtiv mecarbil的比较显示，danicamtiv在增加收缩力的同时对收缩时程的影响更小。

第七阶段为疾病建模。研究者发现一位扩张型心肌病合并心律失常的患者携带DSP基因纯合移码突变（c.4246_4247del）。患者心脏活检显示显著纤维化和DSP连接处缺失伴随Cx43异常分布。研究者利用CRISPR技术建立了DSP突变型（DSPmut）和校正型（DSPcorr）诱导多能干细胞系，并分别构建SF-hCO和DM-hCO。DSPmut DM-hCO表现出TR50延长30%，提示舒张功能障碍。蛋白组学分析显示DSPmut DM-hCO中细胞外基质和免疫调节蛋白广泛失调。研究者测试了两种候选药物：溴结构域和末端外结构域（BET）抑制剂INCB054329和间隙连接增强剂danegaptide。结果显示INCB054329能够完全逆转DSPmut DM-hCO的TR50异常，而danegaptide仅部分改善。蛋白组学分析表明INCB054329的作用机制涉及恢复MYH6表达以及S100A6、SOD3、FXYD6和JMJD7等蛋白的表达水平。

主要结论与意义

本研究成功建立了一种可重复的定向成熟方案DM-hCO，通过短暂激活AMPK和ERR信号通路，显著提升hPS细胞来源心脏类器官的成熟水平。DM-hCO在转录组、蛋白组、代谢能力、肌节蛋白表达和收缩功能等多个维度上均表现出更接近成体心脏的特征。该模型能够准确区分高、低心律失常风险的药物，并成功建模DSP心肌病的舒张功能障碍和纤维化表型。更重要的是，研究利用该模型发现了BET抑制剂INCB054329作为潜在治疗DSP心肌病的候选药物，为精准医学提供了新的思路。DM-hCO平台的建立为心脏发育生物学研究、疾病机制解析和高通量药物筛选提供了多功能工具，在基础研究和转化医学领域均具有重要价值。

研究亮点

本研究的主要创新点在于：第一，首次将AMPK激活与ERR激动联合应用于心脏类器官的定向成熟，并证明该策略能产生与电刺激高度相似的信号激活特征，为无法进行长期电刺激的平台提供了替代方案；第二，系统比较了DM处理与电刺激的磷酸化蛋白组学，揭示了AMPK信号网络在成熟中的核心地位；第三，利用多细胞类器官成功建模了需要细胞间相互作用才能显现的DSP心肌病表型，包括纤维化和舒张功能障碍；第四，在类器官水平发现了BET抑制剂INCB054329的治疗潜力，其机制与MYH6表达恢复相关，为源于罕见基因突变的心肌病提供了可测试的药物筛选平台。此外，本研究还开发了TCF21谱系追踪工具和多种CRISPR基因编辑细胞系，为后续研究奠定了资源基础。